skład i działanie przeciwbakteryjne olejku eterycznego Euphrasia rostkoviana Hayne

Streszczenie

Eyebright, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), jest rośliną leczniczą tradycyjnie stosowaną w Europie w leczeniu różnych zaburzeń zdrowotnych, zwłaszcza jako środek do mycia oczu w leczeniu dolegliwości oczu, takich jak zapalenie spojówek i zapalenie powiek, które mogą być związane z infekcjami bakteryjnymi. Niektóre gatunki Eufrazji były wcześniej zgłaszane do zawierają olejek eteryczny. Jednak skład i bioaktywność oleju E. rostkoviana są nieznane. Dlatego w tym badaniu zbadaliśmy skład chemiczny i działanie przeciwbakteryjne olejku eterycznego eyebright przeciwko niektórym organizmom związanym z infekcjami oczu: Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Pseudomonas aeruginosa i Candida albicans. Analiza GC-MS wykazała ponad 70 składników, z kwasem N-heksadekanowym (18,47%) jako głównym składnikiem, a następnie tymolem (7,97%), kwasem mirystynowym (4,71%), linalolem (4,65%) i anetolem (4,09%). Olejek eteryczny wykazał działanie przeciwdrobnoustrojowe przeciwko wszystkim badanym organizmom z wyjątkiem P. aeruginosa. Najlepszą aktywność obserwowano wobec wszystkich badanych bakterii Gram-dodatnich przy minimalnych stężeniach hamujących wynoszących 512 µg / mL. Jest to pierwszy raport na temat składu chemicznego olejku eterycznego E. rostkoviana i jego aktywności przeciwdrobnoustrojowej.

1. Wprowadzenie

Eyebright, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), była stosowana w Europie od wieków jako tradycyjna medycyna do leczenia różnych chorób. Wywary i napary z kwitnących części nadziemnych są stosowane przeciwko suchemu kaszlowi, chrypce, objawowemu leczeniu przeziębienia, bólu ucha i bólu głowy, katarowi siennemu, ropnym uszkodzeniom skóry lub nieżytom przewodu pokarmowego, ale zwłaszcza jako płukanie oczu w leczeniu i zapobieganiu zaburzeniom oczu, takim jak zapalenie spojówek, zapalenie powiek, zmęczenie oczu, ropne zapalenie oka i stie . Stosowanie herbaty eyebright odnotowano również w medycynie etnoveterinary w leczeniu infekcji oczu krów . Pomimo wieków tradycyjnego stosowania w leczeniu dolegliwości oczu, przeprowadzono tylko jedno prospektywne badanie kohortowe potwierdzające skuteczność kropli do oczu Eufrazja w leczeniu zapalenia spojówek oraz jedno badanie kliniczne badające wpływ miejscowego stosowania kropli do oczu na spożycie antybiotyków u noworodków . Ponadto, aż do ostatnich doniesień na działanie przeciwkandidowe i przeciwbakteryjne niektórych ekstraktów Eufrazji, spektrum działania przeciwbakteryjnego zostało całkowicie nieznane.

efekt terapeutyczny E. rostkoviana można przypisać głównie jego działaniu przeciwutleniającemu, przeciwzapalnemu i przeciwbakteryjnemu . Wśród związków wcześniej zidentyfikowanych w ekstraktach E. rostkoviana, apigenina, luteolina, kaempferol, kwercetyna, kwas kawowy, kwas kumarowy i kwas rozmarynowy mogą być odpowiedzialne za działanie przeciwbakteryjne. Chociaż wcześniej odnotowano obecność olejku eterycznego (EO) w E. officinalis L. i E. stricta Kunt, skład i bioaktywność EO E. rostkoviana są nieznane. Dlatego w tym badaniu zbadaliśmy skład chemiczny i aktywność przeciwdrobnoustrojową eo oka przeciwko panelowi trzech bakterii Gram-dodatnich (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus i S. epidermidis) i trzech bakterii Gram-ujemnych (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae i Pseudomonas aeruginosa) oraz jednego drożdży (Candida albicans), organizmów powszechnie związanych z infekcjami oczu.

2. Materiał i metody

2.1. Chemikalia i materiały roślinne

w firmie Sigma-Aldrich (Praga, Republika Czeska) zakupiono autentyczne normy: borneol, kamfora, karwakrol, karwon, kariofilen, P-cymen, estragol, eukaliptol, limonen, linalol, mentol, Menton, β-myrcene, γ-terpinene i tymol do identyfikacji składników EO, a także antybiotyki kontrolne: cyprofloksacynę i tiokonazol. Jako rozpuszczalniki stosowano heksan (Merck, Praga, Czechy), dimetylosulfotlenek (DMSO) (Lach-Ner, Neratovice, Czechy) i Tween 80 (Sigma-Aldrich, Praga, Czechy). Materiał roślinny użyty do destylacji EO został zakupiony ze źródeł komercyjnych (F-DENTAL, Hodonín, Czechy). Eo ekstrahowano metodą hydrodestylacji przy użyciu aparatu typu Clevenger.

2.2. Analiza chemiczna EO metodą chromatografii gazowej-Spektrometrii Mas (GC-MS)

EO E. rostkoviana analizowano metodą GC-MS przy użyciu Agilent 7890A GC sprzężonego z jedno-kwadrupolowym detektorem masy Agilent 5975c wyposażonym w kolumnę HP-5MS (30 m × 0,25 mm, Folia 0,25 µm) z Agilent (Santa Clara, CA, USA). Heksan zastosowano jako rozpuszczalnik i objętość próbki 1 µL wstrzyknięto w trybie dzielonym (stosunek 20: 1) do wtryskiwacza ogrzanego do 250°C. temperaturę początkową piekarnika ustawiono na 60°C przez 3 minuty, zaprogramowano na 230°c z szybkością 3°C/min, a następnie utrzymywano na stałym poziomie przez 10 minut. Jako gaz nośny użyto helu o natężeniu przepływu 1 mL / min. Analizę MS przeprowadzono w trybie pełnego skanowania, a energię jonizacji elektronów ustawiono na 70 eV. Identyfikacja poszczególnych składników została oparta na porównaniu ich widm masowych i względnych wskaźników retencji z biblioteką National Institute of Standards and Technology Library (NIST, USA) i literaturą , a także na wybiciu autentycznej normy.

2.3. Szczepy bakterii i pożywki do uprawy

standardowe szczepy trzech bakterii Gram-dodatnich Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213 i S. epidermidis ATCC 12228, trzy Gram-ujemne bakterie Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 i Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 oraz jeden drożdże Candida albicans ATCC 10231 uzyskano z Oksoidu (Basingstoke, Wielka Brytania). Bulion Muellera-Hintona skorygowany kationami (MHB) i bulion dekstrozy Sabourauda (SDB) były stosowane jako pożywki uprawowe dla testu mikrodylucji przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybiczych, i równoważono roztworem soli fizjologicznej buforowanej Tris (Sigma-Aldrich, Praga, Czechy). Agar Muellera-Hintona (MHA) i agar dekstrozy Sabourauda (SDA) zostały użyte do późniejszego oznaczania odpowiednio stężeń bakteriobójczych i grzybobójczych. Wszystkie media zostały zakupione od Oxoid (Basingstoke, Wielka Brytania).

2.4. Oznaczanie minimalnego stężenia hamującego (Mic)

Mic oznaczano metodą mikrodilucji bulionu in vitro zgodnie z wytycznymi Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) zmodyfikowanymi zgodnie z zaleceniami zaproponowanymi w celu skutecznej oceny potencjału przeciwinfekcyjnego produktów naturalnych przy użyciu 96-studzienkowych płytek mikrotitera. Krótko mówiąc, EO rozpuszczono w DMSO z dodatkiem Tween 80 i dwa razy seryjne rozcieńczenia przygotowano w MHB dla bakterii i SDB dla drożdży, podczas gdy badane stężenia wahały się od 4 do 2048 µg/mL. Inokulum przygotowano z nocnych hodowli, tak aby początkowe stężenia CFU w mikropłytkach wynosiły odpowiednio 5 × 105 i 2 × 103 CFU/mL dla bakterii i drożdży. Zaszczepione płytki zbadano po 24 h inkubacji w temperaturze 35°C i ponownie po 48 h W przypadku C. albicans. Wzrost drobnoustrojów mierzono spektrofotometrycznie za pomocą fotometru Multiscan Ascent Microplate (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) przy 405 nm. Mic wyrażono jako najniższe stężenia mogące hamować ≥ 80% wzrostu bakterii w porównaniu z dodatnią kontrolą wzrostu. Eksperymenty przeprowadzono w trzech egzemplarzach w trzech niezależnych testach, a wartości mediany wykorzystano do obliczeń Mic. Ze względu na Ostatnio zgłoszoną możliwość wpływu lotnych składników eo na wzrost drobnoustrojów w sąsiednich studzienkach , między rzędami rozcieńczania eo wstawiono dodatnie rzędy kontroli wzrostu w celu wykrycia ewentualnego wpływu na wzrost. Zastosowane rozpuszczalniki nie hamowały wzrostu bakterii w badanych stężeniach. Cyprofloksacynę i tiokonazol stosowano jako antybiotyki referencyjne odpowiednio dla bakterii i drożdży.

2.5. Oznaczanie minimalnego stężenia bakteriobójczego (MBC) i minimalnego stężenia grzybobójczego(MFC)

Po 24 i 48 godzinach inkubacji badanych bakterii i drożdży, z każdej studzienki bez wzrostu drobnoustrojów przeniesiono iloczyny 20 µL do płytek MHA (płytki SDA dla C. albicans). Płytki inkubowano następnie przez 24 godziny w temperaturze 35°C. MBC i MFC oceniano jako ≥99,9% spadek CFU w porównaniu do inokulum, wszystkie przeprowadzono w trzech egzemplarzach w trzech niezależnych testach.

3. Wyniki i dyskusja

3.1. Charakterystyka chemiczna olejów i frakcji bioaktywnych składniki

hydrodestylacja EO za pomocą aparatu typu Clevenger dała 0,02% (w / v) żółtawobrązowego oleju, który ma tendencję do krzepnięcia w temperaturze pokojowej, co jest prawdopodobnie spowodowane wysokim udziałem kwasów tłuszczowych (łącznie 32,23%). Analiza GC-MS EO wykazała obecność ponad 70 składników, z których najliczniejszym składnikiem jest kwas palmitynowy (18,47%), a następnie tymol (7,97%), kwas mirystynowy (4,71%), linalol (4,65%), anetol (4,09%), kwas linolenowy (3,81%), aceton heksahydrofarnesylowy (3,16%), kwas laurynowy (2.79%), α-terpineol (2.39%), and borneol (2.39%). The main compounds are shown also in the chromatogram (Figure 1) and the complete list of EO constituents is presented in Table 1.


Peak number	Component	RI	Area (%)	ID	Peak number	Component	RI	Area (%)	ID

1	1-Hexanold	—	0.10	a	41	Damascenone	1385	0.56	a, b
2	1-Octen-3-ol	981	1.82	a, b	42	Methyl eugenol	1406	0.23	a, b
3	β-Myrcene	992	0.14	a, b, c	43	Caryophyllene	1419	1.28	a, b, c
4	3-Octanol	996	0.13	a, b	44	Geranyl acetone	1455	0.89	a, b
5	p-Cymene	1027	0.81	a, b, c	45	Trans-β-farnesene	1460	0.13	a, b
6	Limonene	1032	0.34	a, b, c	46	Alloaromadendrene	1462	0.12	a, b
7	Eucalyptol	1034	0.25	a, b, c	47	γ-Muurolene	1478	0.25	a, b
8	γ-Terpinene	1062	0.34	a, b, c	48	Germacrene D	1482	0.31	a, b
9	Sabinene hydrate	1070	0.14	a, b	49	Curcumene	1484	1.21	a, b
10	1-Octanol	1074	0.40	a, b	50	Trans-β-ionone	1487	1.53	a, b
11	3,5-Octadienoned	1094	0.16	a, b	51	Valencene	1493	0.13	a, b
12	Linalool	1101	4.65	a, b, c	52	α-Selinened	1495	0.17	a, b
13	α-Thujone	1106	0.88	a, b	53	Epizonarened	1498	0.26	a, b
14	β-Thujone	1118	0.48	a, b	54	α-Muurolene	1500	0.18	a, b
15	Camphor	1146	1.00	a, b, c	55	β-Bisabolene	1510	0.94	a, b
16	Menthone	1156	1.98	a, b, c	56	γ-Cadinene	1515	0.40	a, b
17	2-Nonenal, (E)-	1163	0.10	a, b	57	Nerolidold	1566	0.10	a, b
18	Borneol	1168	2.39	a, b, c	58	Lauric acid	1574	2.79	a, b
19	(+/−)Lavandulol	1170	0.16	a, b	59	Spathulenol	1578	0.61	a, b
20	Menthol	1175	2.02	a, b, c	60	Caryophyllene oxide	1583	1.47	a, b
21	4-Terpineol	1179	1.13	a, b	61	Pseudoiononed	1587	0.18	a, b
22	α-Terpineol	1191	2.39	a, b	62	Humulene epoxide II	1609	0.25	a, b
23	Estragole	1199	0.34	a, b, c	63	Longifolenaldehyded	1613	0.20	a, b
24	Decanal	1207	0.15	a, b	64	τ-Cadinol	1643	0.18	a, b
25	β-Cyclocitrald	1222	0.21	a, b	65	β-Eudesmol	1651	0.13	a, b
26	Thymol methyl ether	1238	0.75	a, b	66	Myristic acid	1771	4.71	a, b
27	Cumin aldehyde	1242	0.23	a, b	67	Hexahydrofarnesyl acetone	1847	3.16	a, b
28	Neral	1244	0.14	a, b	68	Pentadecanoic acid	1865	0.28	a, b
29	Carvone	1246	1.28	a, b, c	69	Farnesyl acetone	1919	0.50	a, b
30	Piperitone	1256	0.18	a, b	70	Palmitic acid	1977	18.47	a, b
31	Geraniol	1258	0.79	a, b	71	Phytold	2114	0.12	a, b
32	Trans-2-decenald	1264	0.11	a, b	72	Linoleic acid	2143	1.90	a, b
33	Geranial	1273	0.15	a, b	73	Linolenic acid	2148	3.81	a, b
34	Anethole	1287	4.09	a, b	74	Tricosane	2300	1.79	a, b
35	Safrole	1289	0.21	a, b	75	Tetracosane	2400	0.16	a, b
36	Thymol	1295	7.97	a, b, c	76	Pentacosane	2500	1.36	a, b
37	Carvacrol	1304	1.96	a, b, c
38	(E,E)-2,4-Decadienal	1318	0.21	a, b		Total identified		98.91
39	Capric acid	1374	0.26	a, b
40	α-Copaene	1377	0.15	a, b

R: retention indices relative to n-alkanes on HP-5MS capillary column (30 m × 0.25 mm, 0.25 m); peak area relative to total peak area in %; ID: identification method; a: identification based on mass spectra matching; b: identification based on retention index; c: identyfikacja oparta na coinjection autentycznej próbki; d: wstępna identyfikacja.

Tabela 1

skład chemiczny olejku eterycznego Euphrasia rostkoviana Hayne.

Rysunek 1

typowy chromatogram olejku eterycznego Euphrasia rostkoviana. Główne komponenty są oznaczone zgodnie z kolejnością ich czasów retencji. (12) linalol; (22) α-terpineol; (34) anetol; (36) tymol; (37) karwakrol; (58) kwas laurynowy; (66) kwas mirystynowy; (67) aceton heksahydrofarnezylowy; (70) kwas palmitynowy; (73) kwas linolenowy.

wysoka zawartość kwasów tłuszczowych została wcześniej stwierdzona w EO E. stricta (łącznie 25,7%), również z najwyższym udziałem kwasu palmitynowego (20,3%) i kwasu mirystynowego (3,9%) . Jednak nie ma innego związku obecnego w znacznej ilości, który wskazywałby na pokrewieństwo tych dwóch gatunków Eufrazji.

3.2. Działanie przeciwbakteryjne

E. rostkoviana EO wykazywała aktywność przeciwko sześciu z siedmiu organizmów badanych przy użyciu Mic w zakresie od 512 do 2048 µg/mL. Bakterie Gram-dodatnie były bardziej wrażliwe niż bakterie Gram-ujemne i drożdże, podczas gdy P. aeruginosa był jedynym organizmem, który nie był hamowany przez olej w najwyższych badanych stężeniach. Mic, MBC i MFC eo wobec wszystkich badanych mikroorganizmów podsumowano w tabeli 2. Stężenia czynne są porównywalne z tymi, które wcześniej zgłaszano, na przykład dla EOs Artemisia annua, eukaliptus globulus, Mentha suaveolens, Myrtus communis, Ocimum basilicum lub Thymus vulgaris, zwłaszcza w przypadku aktywności przeciwkandidalnej . Olej był również bardziej skuteczny niż ekstrakty E. rostkoviana testowane przez Teixeira i Silva przeciwko E. coli, E. faecalis, S. aureus i S. epidermidis. Mic antybiotyków referencyjnych przeciwko bakteriom i drożdżom podatnym na E. rostkoviana EO były zgodne z dopuszczalnymi limitami CLSI i wcześniejszymi sprawozdaniami, odpowiednio .


Microorganism	Euphrasia rostkoviana EO					CIP	TIO
	MIC (µg/mL)		IC50 (µg/mL)		MBC/MFC (µg/mL)	MIC (µg/mL)	MIC (µg/mL)
	24 h	48 h	24 h	48 h	24 h	24 h	48 h

Enterococcus faecalis	512	—	128	—	1024	0.5	—
Staphylococcus aureus	512	—	128	—	>2048	0.5	—
Staphylococcus epidermidis	512	—	256	—	>2048	0.25	—
Klebsiella pneumoniae	2048	—	1024	—	>2048	0.125	—
Escherichia coli	2048	—	1024	—	>2048	0.015	—
Pseudomonas aeruginosa	>2048	—	>2048	—	>2048	0.125	—
Candida albicans	128	1024	128	1024	2048	—	0.063

The growth inhibition was measured after 24 h and 48 h of incubation in case of C. albicans; EO: essential oil; CIP: ciprofloxacin; TIO: tioconazole; MIC: minimum inhibitory concentration; IC50: inhibitory concentration causing ≥50% of bacterial growth; MBC: minimum bactericidal concentration; MFC: minimum fungicidal concentration.

Table 2

The inhibitory and cidal concentrations of E. rostkoviana essential oil.

ponieważ zawartość głównego składnika eo kwasu palmitynowego nie przekracza 20% i istnieje ponad 10 innych związków przeciwdrobnoustrojowych w zakresie od 1 do 8%, trudno jest zasugerować główne czynniki odpowiedzialne za działanie przeciwdrobnoustrojowe E. rostkoviana eo. Kwas palmitynowy został wcześniej zidentyfikowany jako główny związek frakcji aktywnych przeciwko bakteriom Gram-ujemnym, ale nie Gram-dodatnim . Z drugiej strony wiadomo, że średniołańcuchowe nasycone kwasy tłuszczowe i długołańcuchowe nienasycone kwasy tłuszczowe hamują szczególnie bakterie Gram-dodatnie . Ponadto kwas laurynowy działa również przeciwko wielu grzybom . Tak więc działanie przeciwdrobnoustrojowe EO jest prawdopodobnie spowodowane złożonym działaniem przeciwdrobnoustrojowych kwasów tłuszczowych z innymi dobrze znanymi związkami przeciwdrobnoustrojowymi zidentyfikowanymi w EO, takimi jak anetol, borneol, kamfora, karwakrol, linalol, mentol, α-terpineol lub tymol.

4. Wnioski

podsumowując, analiza chemiczna wykazała szereg substancji czynnych przeciwdrobnoustrojowych obecnych w E. rostkoviana EO i jego działanie przeciwgrzybicze i przeciwbakteryjne przeciwko bakteriom Gram-dodatnim i Gram-ujemnym zostało potwierdzone. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą jest to pierwszy raport na temat składu i aktywności przeciwdrobnoustrojowej E. rostkoviana EO.

konflikt interesów

autorzy oświadczają, że nie ma konfliktu interesów w związku z publikacją niniejszego artykułu.

podziękowania

praca ta została wsparta finansowo przez Europejską Fundację Nauki oraz projekt Ministerstwa Edukacji, Młodzieży i Sportu Republiki Czeskiej CZ.1.07/2.3.00/30.0040; przez S-grant Ministerstwa Edukacji, Młodzieży i Sportu Republiki Czeskiej; oraz przez czeski Uniwersytet Przyrodniczy Praga projekt IGA 20155012. Autorzy są wdzięczni Slavce Barlakovej za angielską korektę.