Dr Michelle Dotzert
Jaka jest różnica między Southern, Northern i Western Blot?
do identyfikacji unikalnych białek i sekwencji kwasów nukleinowych stosuje się różne techniki blottingu. Protokoły Southern, northern i western blot są podobne i zaczynają się od elektroforetycznej separacji fragmentów białka i kwasu nukleinowego na żelu,które są następnie przenoszone do membrany (membrana nitrocelulozowa, membrana difluorku poliwinylidenu (PVDF) itp.), gdzie są unieruchomione. Umożliwia to znakowane radioizotopem lub enzymatycznie znakowane przeciwciało lub sondy DNA do wiązania unieruchomionego celu, a cząsteczki będące przedmiotem zainteresowania mogą być wizualizowane za pomocą różnych metod. Techniki blottingu dobierane są w oparciu o cząsteczkę docelową: DNA, RNA lub białko. (Rysunek 1, Tabela 1).
Southern Blot
Southern blot są używane do określania tożsamości, wielkości i obfitości określonych sekwencji DNA. Protokół Southern blot rozpoczyna się od ekstrakcji DNA z komórek lub tkanek, który jest następnie enzymatycznie trawiony w celu wytworzenia fragmentów DNA. Fragmenty są oddzielane wielkością na żelu agarozowym lub poliakrylamidowym za pomocą elektroforezy. Mniejsze fragmenty będą migrować dalej na żelu niż większe. Po elektroforezie DNA na żelu jest przenoszone na membranę nylonową. Membrana jest inkubowana z sondą kwasu nukleinowego, która ma sekwencję homologiczną do sekwencji docelowej i jest znakowana radioaktywnością, barwnikiem fluorescencyjnym lub enzymem zdolnym do generowania sygnału chemiluminescencyjnego. Hybrydyzacja komplementarnych sekwencji zachodzi podczas inkubacji, a niehybrydyzowana sonda jest usuwana przez przemywanie buforem. W pełni hybrydyzowane, znakowane cząsteczki sondy pozostaną związane z plamą. Metody wykrywania różnią się w zależności od etykiety sondy; sondy znakowane radioizotopem są wizualizowane za pomocą filmu rentgenowskiego lub fosforymowania, a sondy znakowane enzymatycznie są wizualizowane za pomocą podłoża chemiluminescencyjnego.
protokół Southern blot
- Izolacja DNA
- trawienie restrykcyjne: trawienie DNA enzymem restrykcyjnym i w razie potrzeby koncentracja strawionego DNA.
- elektroforeza w żelu: przygotować żel agarozowy i bufor TAE lub TBE (wybór bufora zależy od czasu trwania cyklu i wielkości fragmentów DNA). Załaduj próbki do studni i dołącz marker masy cząsteczkowej DNA. Włącz żel.
- Transfer:
- umieść żel w pojemniku z roztworem denaturacyjnym i myj dwukrotnie przez 15 minut na shakerze.
- spłucz wodą, a następnie umyj roztworem neutralizacji.
- w poprzednim kroku zacznij przygotowywać Papier Whatman i membranę nylonową do transferu.
- zmontuj urządzenie transferowe z membraną, papierem Whatman i żelem i przenieś w buforze SSC lub SSPE.
- Po zakończeniu transferu, połącz dna w sieciowniku, a następnie przepłucz membranę.
- :
- blokowanie zmniejsza niespecyficzne wiązanie z membraną. Przygotować roztwór pre-hybrydyzacji i dodać próbkę DNA. Usunąć plamę z sieciującego łącznika, dodać roztwór przed hybrydyzacją i inkubować.
- hybrydyzacja:
- przygotować mieszaninę sondy (komplementarną nić DNA) i bufor.
- Usuń roztwór przed hybrydyzacją i inkubuj plamkę z sondą (czasy inkubacji będą się różnić w zależności od zastosowania).
- po inkubacji wykonaj płukanie o niskiej surowości, a następnie płukanie o wysokiej surowości, aby udoskonalić DNA.
- wykrywanie sondy:
- przepłukać membranę, przenieść do pojemnika z roztworem blokującym i inkubować.
- wyrzucić roztwór blokujący, zastąpić roztworem przeciwciał i inkubować.
- wyrzucić roztwór przeciwciała, przemyć membranę.
- postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta dotyczącymi wykrywania chemiluminescencji.
Northern Blot
Northern blot są używane do określania tożsamości, wielkości i obfitości określonych sekwencji RNA. Protokoły Northern blot rozpoczynają się od izolacji RNA, a techniki separacji różnią się w zależności od wielkości RNA. Duże RNA są oddzielane elektroforezą na formaldehydowym żelu agarozowym lub glioksalowym żelu agarozowym, co zapobiega normalnemu parowaniu zasady i utrzymuje RNA w stanie denaturacji. Małe RNA są rozdzielane na żelu poliakryloamidowym denaturującym (mocznik). RNA jest następnie przenoszone z żelu do błony nylonowej, która jest następnie inkubowana z radioaktywnie lub nieizotopowo znakowaną sondą RNA, DNA lub oligodeoksynukleotydową. Niehybryzowana sonda jest usuwana przez mycie buforem. Sondy znakowane radioizotopem są wizualizowane za pomocą filmu rentgenowskiego, a sondy znakowane enzymatycznie są wizualizowane za pomocą chemiluminescencji.
protokół Northern blot
- izolacja RNA
- elektroforeza:
- dla żelu agarozowego Formaldehydu: przygotuj żel i włóż tacę z żelem do aparatu. Napełnij buforem MOPS, załaduj próbki i dołącz marker masy cząsteczkowej. Uruchom żel, a następnie przyciąć żel przed rozmazaniem.
- dla glioksalowego żelu agarozowego: przygotować żel i włożyć tacę z żelem do aparatu. Napełnij buforem MOPS, przygotuj próbki i załaduj do studni wraz z drabiną RNA.
- dla denaturującego żelu poliakrylamidowego: odlać żel i zamontować go w jednostce elektroforezy. Przygotuj próbki, załaduj do żelu i uruchom buforem TBE.
- Transfer:
- dla żelu agarozowego formaldehydu lub glioksalowego żelu agarozowego: umyć żel w SSC, a następnie zmontować jednostkę transferową z żelem, papierem filtracyjnym i membraną nylonową. Po zakończeniu transferu umieść membranę w siatce UV.
- w przypadku denaturującego żelu poliakrylamidowego: zmontować jednostkę transferową, w tym żel, bibułę filtracyjną i membranę nylonową, aby zapewnić ich zalanie TBE. Po zakończeniu transferu umieść membranę w usieciowanym łączniku UV, aby przymocować RNA do membrany.
- wstępna hybrydyzacja (blokowanie):
- wstępna hybrydyzacja błony w roztworze hybrydyzacji.
- hybrydyzacja:
- Dodaj sondę do roztworu hybrydyzacji i inkubuj.
- przemyć membranę w myjniach o niskiej strunowości, aby usunąć roztwór hybrydyzacji i niehybrydyzowaną sondę, i myjniach o wysokiej strunowości, aby usunąć częściowo hybrydyzowane cząsteczki.
- postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta dla detekcji chemiluminescencyjnej.
Western Blot
Western blot są używane do określenia tożsamości, wielkości i obfitości określonych białek w próbce. Protokół Western blot rozpoczyna się od przygotowania próbki lizatu z hodowli tkankowej lub komórkowej i separacji na żelu poliakrylamidowym poprzez elektroforezę. Oddzielone białka są następnie przenoszone do membrany nitrocelulozy lub difluorku poliwinylidenu (PVDF). Błonę inkubuje się ze środkiem blokującym, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu, a następnie inkubuje się z pierwotnym przeciwciałem, aby związać interesujące białko. Istnieją dwie metody wykrywania, bezpośrednia i pośrednia. Bezpośrednie wykrywanie (fig.2) opiera się na znakowanym przeciwciale pierwotnym, podczas gdy pośrednie wykrywanie wymaga pierwszorzędowego przeciwciała skierowanego przeciwko białku docelowemu, a drugorzędowego przeciwciała skierowanego przeciwko klasie lub podklasie immunoglobiny gatunku pierwszorzędowego przeciwciała (Fig. 3). Metody wizualizacji obejmują testy kolorymetryczne, w których wytwarzany jest kolorowy osad, chemiluminescencję i fluorescencję.
protokół Western blot
- przygotuj lizat z hodowli komórkowej lub tkanki.
- przygotowanie próbki:
- Określ stężenie białka w każdej próbce za pomocą testu ilościowego białka (tj. Bradford assay).
- Dodaj równą objętość 2x bufora Laemmli do każdej próbki.
- niektóre próbki mogą wymagać redukcji lub denaturacji, osiąga się to przez gotowanie próbek w buforze.
- elektroforeza:
- przygotuj żel SDS-PAGE, załaduj próbki wraz z markerem masy cząsteczkowej.
- Uruchom żel w buforze running.
- Transfer:
- po elektroforezie zmontuj jednostkę transferową, w tym membranę żelową, PVDF lub nitrocelulozową i papier filtracyjny.
- Przenieś białka do błony za pomocą bufora transferowego.
- barwienie przeciwciała (wykrywanie pośrednie):
- przygotować bufor blokujący i inkubować błonę w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania.
- inkubować błonę z pierwotnym przeciwciałem rozcieńczonym w buforze blokującym.
- przemyć błonę w TBST i inkubować ze sprzężonym przeciwciałem wtórnym rozcieńczonym w buforze blokującym.
- umyj membranę w TBST.
- postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta dla detekcji chemiluminescencyjnej.