4.2.1 polimeraza II

chociaż terminacja transkrypcji była znacznie mniej badana niż jej inicjacja, ostatnie 25 lat ujawniło, że dobrze zaplanowane i dokładne uwolnienie powstających transkrypcji i polimeraz RNA z szablonu DNA ma kluczowe znaczenie dla losu RNA, jak również dla ogólnego utrzymania genomu.

późniejsze prace ujawniły, że Szczur1 w drożdżach i Xrn2 u ludzi były odpowiedzialne za aktywność torped i że brak obu enzymów, jak również aktywatora Rai1 w drożdżach, prowadzi do defektu terminacji, który przejawia się jako obszerny odczyt transkrypcji. Możliwe jest również, że roślinny homologi Rat1, Arabidopsis AtXRN3, działa jako czynnik zakończenia transkrypcji podobnie jak Rat1/Xrn2. Podejście o wysokiej przepustowości ujawniło nagromadzenie niekodujących transkryptów z 3 ’ – końca mRNA i genów microRNA (miRNA) w mutancie xrn3 knockdown, które mogą odpowiadać transkrypcyjnym cząsteczkom przeczyszczającym . W związku z tym AtXRN3 może uczestniczyć w globalnym nadzorze RNA 3′-end w wyniku jego aktywności terminacji torped.

mechanizm torpedowy zależy od aktywności katalitycznej egzonukleazy Szczura1, a nie tylko od jej obecności . Monofosforylowany substrat RNA dla Rat1 / Xrn2 podczas syntezy mRNA jest wytwarzany w wyniku rozszczepiania cotranskrypcyjnego (CoTC) w miejscu poliadenylacji za pomocą maszyny do tworzenia 3′-końca mRNA. Dokładniej, proces ten jest przeprowadzany przez komponent Ysh1 CF II w drożdżach lub odpowiednią podjednostkę cpsf-73 czynnika swoistości ludzkiego rozszczepiania i poliadenylacji (Cpsf) (recenzja w Ref. ). Zaproponowano dwa czynniki mające przyczynić się do skutecznego rozwiązania umowy: siła sygnału Poli(a) i działanie egzonukleazy degradującej produkt rozszczepiania 5′, co ułatwia wstrzymanie polimerazy za miejscem Poli(a) i sprzyja jej uwalnianiu . Z drugiej strony zaburzone zakończenie zależne od szczura nie znosi prawidłowego rozpoznawania Poli (a) i rozszczepiania mRNA .

dodatkowe miejsca wejściowe Szczura1 / Xrn2 mogą powstać w wyniku Autokatalitycznego CoTC poniżej miejsca Poli(A) u ssaków lub rozszczepienia endonukleolitycznego przez rnt1 u drożdży . Ten ostatni przypadek został zgłoszony jako bezpieczny w przypadku awarii mechanizm zakończenia dla genów kodujących białko, który wraz ze szlakiem, w którym pośredniczy kompleks NRD1/Nab3/Sen1 (NRD), zapewnia tryb zapasowy dla uwalniania Pol II.

pomimo, że do skutecznego zakończenia Pol II wymagane jest zastosowanie Rat1 / Xrn2, Rat1 nie uruchamia zakończenia in vitro, a jego aktywność degradacji 5′-3′ nie jest wystarczająca do pobudzenia dysocjacji polimerazy in vivo. Konsekwentnie, drożdże xrn1 skierowane do jądra komórkowego są zdolne do cotranscriptional degradacji rodzącego się RNA, ale nie ratują wad terminacji spowodowanych niedoborem Szczura1. Obserwacje te sugerują, że egzonukleaza doganiająca polimerazę jest konieczna, ale niewystarczająca do destabilizacji kompleksu elongacyjnego, a dodatkowy element mechanizmu torpedowego działa podczas terminacji. Postulowano, że unikalna cecha Rat1, Rozszerzona domena wieży, nieobecna w białkach Xrn1, może być odpowiedzialna za jej właściwości końcowe . Można sobie wyobrazić, że domena wieży podlega pewnym modyfikacjom lub służy jako interfejs do interakcji z czynnikami zwiększającymi zakończenie. Jednym z możliwych kandydatów na czynniki stymulujące terminację zależną od Szczura1 jest helikaza RNA Sen1, która jest kluczowym składnikiem ścieżki terminacji dla niekodujących RNA w drożdżach (patrz poniżej), która również przyczynia się do terminacji genów kodujących białko, z najsilniejszym wpływem na krótsze mRNA . Sen1 oddziałuje poprzez swoją N-końcową domenę z największą podjednostką Pol II, Rpb1 i upośledzającą aktywność helikazy Sen1 upośledza dystrybucję Pol II w całym genomie nad kodującymi i niekodującymi genami . Wykazano, że ludzki homologi Sen1, Senataksyna, bezpośrednio Promuje zakończenie transkrypcji za pośrednictwem Xrn2 poprzez rozdzielenie hybryd RNA: DNA (pętli R) utworzonych za wydłużającym się Pol II, głównie w miejscach pauzy bogatej w G poniżej miejsca Poli(a). Działanie to ułatwia dostęp Xrn2 do produktów rozszczepiania Poli(a) site 3′ i tym samym przyczynia się do rekrutacji egzonukleazy torpedowej. Uważa się, że sposób działania drożdży Sen1 jest podobny .

pytanie bez odpowiedzi brzmi, w jaki sposób Rat1 jest rekrutowany do polimerazy wydłużającej. Kilka obserwacji potwierdza asocjację Rat1 poprzez białka oddziałujące z domeną końcową Pol II C (CTD) poprzez ich domenę oddziałującą CTD (CID), a mianowicie podjednostkę Pcf11 czynnika rozszczepiania drożdży IA (CFIA) i Rtt103 (regulator transpozycji Ty1 103). Rat1 i Rai1 są obecne w promotorach i regionach kodujących z silnym wzbogaceniem na 3′-końcach genów. Wykazano, że interakcja funkcjonalna między Rat1 a Pcf11 ułatwia wzajemne współwartościowanie obu czynników: Rat1 łączy zakończenie z tworzeniem 3′-końca poprzez stymulowanie rekrutacji 3′-końcowych czynników przetwarzania, zwłaszcza podjednostek CFIA Pcf11 i Rna15, podczas gdy Pcf11 przyczynia się do Stowarzyszenia Rat1 w obrębie Poli(a). Wykazano również, że ludzki Pcf11 zwiększa degradację powstającego RNA i promuje zakończenie transkrypcji . Z kolei Rtt103, który również kojarzy się w pobliżu 3 ’ – końców genów, współwystępuje z Rat1, Rai1 i Pcf11 i razem z Pcf11 wspólnie rozpoznaje ser2-fosforylowany CTD wydłużającego Pol II . Z drugiej strony, rozkład Rat1 w genach nie ulega zmianie w przypadku braku Rtt103 . Ponadto Rat1 kończy również transkrypcję przez Pol I, w której brakuje CTD, co sugeruje, że rekrutacja Rat1 może również nastąpić za pośrednictwem innych mechanizmów. W rzeczywistości, związek hXrn2 był mediowany przez p54nrb / PFS (protein-associated splicing factor), które są wielofunkcyjnymi białkami zaangażowanymi w transkrypcję, splicing i poliadenylację . Rolę p54nrb / PFS w zakończeniu transkrypcji Pol II wykazano również w C. elegans.

oprócz mRNA, Pol II syntetyzuje szeroki zakres niekodujących transkryptów, w tym małe jądrowe RNA i snorna oraz różne niestabilne RNA. U drożdży transkrypcja tych stosunkowo krótkich gatunków kończy się głównie alternatywnym kompleksem NRD, złożonym z białek wiążących RNA Nrd1 i Nab3 oraz zależnej od ATP helikazy Sen1 . Ponieważ mechanizm ten najprawdopodobniej nie pociąga za sobą koranskrypcyjnego rozszczepiania endonukleolitycznego , uważa się, że aktywność odwijania hybrydowego RNA:DNA Sen1 jest niezbędna do dysocjacji polimerazy, być może w sposób podobny do bakteryjnej helikazy Rho DNA-RNA. Rho prawdopodobnie destabilizuje kompleks elongacyjny poprzez translokację wzdłuż i usunięcie powstającego RNA z polimerazy . Alternatywny model allosteryczny zakłada, że Rho ładuje się na polimerazę i indukuje zmiany w miejscu aktywnym enzymu w miejscach zakończenia . Oba tryby działania mogą mieć zastosowanie w przypadku helikazy Sen1.

chociaż Rat1 jest rekrutowany do genów snoRNA, szczególnie intronicznych, zależne od NRD zakończenie transkryptów snoRNA nie jest osłabione, gdy go brakuje, i dlatego zasugerowano, że uczestniczy w niektórych przedwczesnych zdarzeniach zakończenia . Nadal jednak możliwe jest, że mechanizm torpedy Rat1 może przyczynić się do zakończenia transkrypcji snoRNAs, takich jak U3 lub snR40, których 3′-koniec jest uwalniany przez rozszczepienie Rnt1, które ujawnia pozostały rodzący się transkrypt 5′-koniec dla ataku Rat1 .