bakteriofagi, zwane również fagami, są wirusami, które konkretnie infekują bakterie i możemy potwierdzić ich obecność i określić je ilościowo za pomocą narzędzia zwanego testem płytki nazębnej. Bakteriofagi infekują swoich podatnych gospodarzy, najpierw przyłączając się do ściany komórkowej bakterii i wstrzykując ich materiał genetyczny. Następnie przejmują biosyntetyczną maszynę komórki, aby replikować ich DNA i produkować liczne cząsteczki fagów potomnych, które następnie uwalniają poprzez lizowanie i zabijanie komórki gospodarza.

ta aktywność lityczna jest podstawą szeroko stosowanej techniki wyliczania fagów znanej jako test płytki nazębnej lub test podwójnej warstwy agaru. Tutaj mieszankę bakteriofagową przygotowuje się najpierw w roztopionym bulionie odżywczym zawierającym agar o niskim stężeniu. Wszystkie bakterie użyte w mieszance powinny być żywe i aktywnie dzielić się w fazie ich wzrostu, co zapewni, że duży procent bakterii jest żywotny i zdolny do tworzenia gęstego trawnika wokół tablic. Następnie ta stopiona mieszanka agaru bakteryjno-fagowego jest rozprowadzana na bardziej solidnym, skoncentrowanym pożywce agarowej, która jest już zestalona na szalce Petriego. Podczas inkubacji w temperaturze pokojowej bulion agarowo-fagowo-bakteryjny o niskim stężeniu również zestala się, tworząc miękką nakładkę agarową.

tutaj komórki bakteryjne mogą czerpać dodatkowe składniki odżywcze z dolnej warstwy i powinny szybko namnażać się, aby wytworzyć zbiegający się trawnik bakterii. Jednakże, ponieważ cząstki fagów są również obecne w miękkiej warstwie, będą one infekować i replikować ich materiał genetyczny wewnątrz bakterii, osiągając kulminację w lizie komórek, która uwalnia wiele potomstwa. Te potomstwo fagów następnie infekuje sąsiednie komórki, ponieważ półstały stan warstwy bakteryjno-fagowej ogranicza ich ruch do bardziej odległych komórek gospodarza. Ten cykl infekcji i lizy trwa przez wiele rund, zabijając dużą liczbę bakterii w zlokalizowanym obszarze. Efektem niszczenia sąsiednich komórek jest wytworzenie pojedynczej, okrągłej, jasnej strefy, zwanej płytką nazębną, którą można zobaczyć gołym okiem, skutecznie wzmacniając aktywność lityczną bakterii faga i umożliwiając ich wyliczenie.

liczba płytek na szalce Petriego jest określana jako jednostki tworzące płytki nazębne lub PFU, i pod warunkiem, że początkowe stężenie bakteriofagów było wystarczająco rozcieńczone, powinno bezpośrednio odpowiadać liczbie zakaźnych cząstek fagów w oryginalnej próbce. Technika ta może być również stosowana do charakteryzowania morfologii płytki nazębnej, do pomocy w identyfikacji typów fagów lub do izolowania mutantów fagowych. W tym laboratorium dowiesz się, jak wykonać test płytki nazębnej w celu wyliczenia fagów, na przykładzie fagów T7 E. coli.

najpierw zidentyfikuj odpowiednie podłoże do hodowli komórek bakteryjnych gospodarza i bakteriofaga. Tutaj do hodowli E. coli i faga T7 użyto bulionu lysogeny lub pożywki LB. Następnie weź trzy czyste szklane butelki i oznacz je mediami, nazwą, a następnie pierwszą jako lb-bulion, drugą jako lb-Bottom Agar, a trzecią jako lb-Top Agar. Teraz zważyć cztery gramy wstępnie sformułowanego proszku LB w trzech zestawach, a następnie przenieść jeden zestaw ważonych wysuszonych mediów do każdej butelki. Dodaj 200 mililitrów wody do pierwszej butelki. Zawartość wymieszać za pomocą mieszadła magnetycznego.

następnie, za pomocą pH-metru i stałego mieszania, doprowadzić końcowe pH do 7,4 przez dodanie wodorotlenku sodu lub kwasu solnego. Powtórz dodawanie wody i regulację pH dla pozostałych dwóch butelek. Teraz zważyć trzy gramy proszku agaru i dodać go do drugiej butelki, aby uzyskać 1,5% agaru dolnego. Na koniec zważyć 1. 2 g agaru i dodać go do trzeciej butelki, aby .6% LB top agar. Stan bulionu w butelce nie wymaga dodatku agaru. Zakryj butelkę pół szczelnie, a następnie sterylizuj media przez autoklawowanie w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 20 minut. Po zakończeniu wyjmij butelki z mediów z autoklawu i natychmiast przekręć zakrętki butelek, aby je całkowicie zamknąć, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Przechowywać lb-bulion i LB-Top agar media na ławce do późniejszego wykorzystania. Umieść Agar lb-Bottom do ostygnięcia w łaźni wodnej, która jest ustawiona na około 45 stopni Celsjusza.

gdy Agar lb-Bottom osiągnie około 45 stopni Celsjusza, przenieś go na stół roboczy. Następnie wysterylizuj przestrzeń roboczą za pomocą 70% etenolu. Następnie dodać 450 mikrolitrów sterylnego jednego molowego chlorku wapnia do stopionego agaru dolnego, aby uzyskać końcowe stężenie 2.25 mm. Delikatnie obracaj butelką, aby wymieszać. Następnie Ustaw siedem czystych naczyń Petriego. Na spodzie każdej potrawy należy podać nazwę nośnika i datę przygotowania. Następnie wlać 15 mililitrów dolnego agaru do każdej z siedmiu naczyń Petriego. Pozostawić płytki do Ustawienia na kilka godzin lub na noc w temperaturze pokojowej. Po ustawieniu płytki hodowlane można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kilka dni, w razie potrzeby, do góry nogami, aby zminimalizować kondensację. Przenieść płytki Petriego z lodówki o czterech stopniach Celsjusza do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę przed badaniem.

dzień przed przystąpieniem do testu należy wyhodować E. coli. Tutaj zaszczepiono 10 mikrolitrów Kultury E. coli do 10 mililitrów bulionu LB. Umieść bakterie do wzrostu przez noc w inkubatorze wytrząsającym ustawionym na 37 stopni Celsjusza przy 160 obr. / min. Następnie, w dniu testu, usunąć kulturę bakteryjną z inkubatora. Nasiona świeże 10 mililitrów świeżego bulionu LB z 0,5 mililitrów nocnej Kultury. Umieść te komórki, aby urosły do inkubatora wstrząsającego ustawionego na 37 stopni Celsjusza przy 160 obr. / min. Następnie użyj spektrofotometru, aby sprawdzić, kiedy ta kultura osiąga wzrost fazy logarytmicznej, wskazywany przez gęstość optyczną od 0,5 do 0,7. Gdy OD osiągnie ten poziom, zatrzymaj inkubację, przenosząc kulturę komórkową do ławki. Są teraz gotowe do użycia w teście nakładania fagów.

miana fagów mogą się różnić wykładniczo w różnych typach fagów i próbkach. Aby je skutecznie policzyć, należy je rozcieńczyć, aby wytworzyć szeroki zakres stężeń fagów. W dniu badania należy wytworzyć serię rozcieńczeń fagowych w zakresie od jednej dziesiątej do jednej milionowej stężenia, stosując technikę 10-krotnego rozcieńczenia. W celu uzyskania statystycznie istotnych i dokładnych danych należy przeprowadzić rozcieńczenie seryjne w trzech egzemplarzach.

następnie stopić zestalony agar LB-top za pomocą mikrofali. Następnie umieść go w łaźni wodnej, która jest ustawiona w temperaturze 45 stopni Celsjusza na jedną godzinę. Po godzinie zebrać z inkubatora płytki Petriego zawierające dolną warstwę agaru. Oznacz płytki stężeniem fagów i datą oznaczenia. Następnie ustawić siedem czystych probówek. Każdą probówkę należy oznakować numerem seryjnego rozcieńczenia fagów i wyznaczyć jeden jako kontrolny.

gdy agar LB-top osiągnie 45 stopni Celsjusza, przenieś go na stół roboczy. Teraz dodaj 450 mikrolitrów jednego molowego chlorku wapnia do 200 mililitrowego agaru, aby uzyskać końcowe stężenie 2,25 milimolara. Delikatnie obracaj butelką, aby wymieszać. Następnie dodaj 35 mililitrów agaru LB-top i cztery mililitry zawiesiny bakteryjnej do sterylnej stożkowej rurki. Delikatnie obracaj, aby równomiernie rozprowadzić komórki, ale unikaj wstrząsania, aby zapobiec spienieniu się.

teraz, aliquot pięć mililitrów tej bakterii-top agar wymieszać do każdej z siedmiu probówek. Następnie przenieść 100 mikrolitrów seryjnie rozcieńczonych próbek bakteriofagów i mediów kontrolnych, które powinny być po prostu mediami bez bakteriofagów,do odpowiednio oznakowanych probówek. Delikatnie obracać mieszaninę, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie. Delikatnie przenieść pięć mililitrów mieszanki bakteriofagów na odpowiednią płytkę Petriego. Równomiernie rozprowadzić mieszankę na całej powierzchni, delikatnie obracając płytkę Petriego.

gdy wszystkie płytki Petriego są warstwami mieszanki, należy pozostawić do zestalenia górnej warstwy przez inkubację w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po zakończeniu tych czynności powtórz proces dla drugiego, a następnie trzeciego zestawu płytek Petriego, używając pozostałych dwóch zestawów rozcieńczeń fagowych. Uszczelnić każde naczynie parafilmem i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Umieścić płytkę hodowlaną do góry dnem w odpowiedniej temperaturze na 24 godziny lub do czasu rozwoju płytek. Tutaj płytki umieszczano w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na jeden dzień, co było stymulującym warunkiem wzrostu E. coli i faga T7.

płytki pojawią się po jednym do pięciu dni inkubacji, w zależności od gatunku bakterii, warunków inkubacji i wyboru pożywki. Tutaj tablice były widoczne po jednym dniu inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zacznij od sprawdzenia płytek oznaczonych kontroli i upewnij się, że nie płytki zostały utworzone w tych płyt, jak to wskazuje na zanieczyszczenie wirusowe. W celu określenia miana fagowego w oryginalnej próbce należy najpierw rozpocząć od płytek zawierających najbardziej rozcieńczoną próbkę fagową i policzyć płytki bez zdejmowania pokrywek, zaznaczając je, aby wskazać, które z nich zostały już policzone. Powtórz liczenie dla każdej płytki w każdym zestawie. Niektóre płyty mogą mieć zbyt wiele lub zbyt mało tabliczek, aby je policzyć. Rozważ 10 do 150 jako idealną liczbę płytek.

następnie Wygeneruj tabelę zawierającą wartości liczby tablic dla różnych rozcieńczeń i replikatów. Następnie Oblicz średnie wartości liczby płytek rozcieńczających, które zawierały idealną liczbę płytek. W tym przykładzie była to średnia liczba płytek utworzonych w 10 do minus trzech i 10 do minus czterech płyt rozcieńczających. Teraz dostosuj współczynnik rozcieńczenia fagów, dzieląc uzyskane średnie wartości płytki nazębnej przez odpowiednie współczynniki rozcieńczenia fagów. Tutaj, średnia liczba płytek utworzonych do 10 do minus trzech i 10 do minus czterech płytek rozcieńczających, została podzielona przez ich odpowiednie współczynniki rozcieńczenia, aby uzyskać liczbę jednostek tworzących płytki, lub PFU, w 100 mikrolitrach mieszaniny fagów. Aby przeliczyć wartość na PFU na mililitr, należy pomnożyć wygenerowane wartości przez 10, ponieważ podczas etapu przygotowania nakładki bakteriofagowej użyto tylko 100 mikrolitrów mieszaniny rozcieńczania fagów, co dało dodatkowy współczynnik rozcieńczenia wynoszący 10. Na koniec obliczyć średnią wartości uzyskanych z różnych płyt rozcieńczających. Da to średnią liczbę PFU na mililitr. Liczba PFU odpowiada liczbie infekcyjnych cząstek fagów w oryginalnej próbce.