cytopathic effect (CPE): jak wirusy uciekają przed morderstwem

wirusy z definicji są niewidoczne dla naszych oczu. Są to nanostruktury, które mogą stać się widoczne tylko za pomocą mikroskopii elektronowej, techniki, która jest czasochłonna i niedostępna dla wszystkich. W konsekwencji wirusolog musi znaleźć alternatywy, aby móc pracować i badać przedmiot zainteresowania. Praktyczny sposób „widzenia” i pośredniego pomiaru infekcji wirusowej polega na patrzeniu na uszkodzenia, które wirus powoduje w komórce. To cierpienie lub uszkodzenie jest znane jako efekt cytofatyczny (CPE), a jego pomiar jest szeroko stosowany w laboratoriach wirusologicznych na całym świecie.

CPE jest bardzo podstawowym podejściem do zrozumienia, w jaki sposób wirus infekuje komórkę, ale to nie znaczy, że jest on używany tylko w podstawowych badaniach naukowych. Pomiar CPE może być również bardzo przydatnym odczytem dla firm farmaceutycznych i laboratoriów diagnostycznych.

co to jest efekt cytofatyczny wywołany wirusem?

wirusy są pasożytami, które potrzebują komórki gospodarza do replikacji. Po wejściu do komórki przejmują mechanizmy komórkowe, aby produkować własne białka, kwas nukleinowy i błonę (w razie potrzeby).

ponieważ wirus zajmuje czynniki komórkowe, które są w inny sposób wykorzystywane przez komórkę, jego replikacja może zmienić podstawowe funkcje komórek gospodarza, a nawet je zniszczyć. Zestaw zmian komórkowych lub zmian wynikających z infekcji wirusowej są znane jako CPE. Są to zwykle negatywne zmiany, które mogą powodować zmiany strukturalne, metaboliczne lub funkcjonalne w zakażonej komórce. Z czasem CPE może powodować patologiczne skutki wirusa (choroby).

klasyczne przykłady efektu cytopatycznego

dobrze znanym wywołanym wirusem CPE jest śmierć komórki (sprawdź film z umierającą komórką w ). Wiele wirusów zabija komórki poprzez lizę lub indukując apoptozę. Na przykład HIV jest znany z zabijania limfocytów T CD4+, co jest głównym powodem, dla którego zakażone osoby ulegają obniżeniu odporności.

w laboratorium łatwym sposobem na zabicie linii komarów (jak C6 / 36) lub komórek Vero jest zainfekowanie jej dowolnym słynnym arbovirusem, takim jak Chikungunya, denga lub Zika. Po kilku dniach infekcji komórki rozpadają się tuż przed oczami (rys. 1).

Rysunek 1 / komórki Vero zostały zainfekowane wirusem Zika. Po 72 h infekcji, wyraźny CPE jest widoczny przez obecność debri komórki w wyniku śmierci komórki.

Innym przykładem CPE jest formacja syncytia. Komórki zakażone przez wirusy otoczkowe wyrażają białka wirusowe na błonie osocza, które są używane przez wirusy do pośredniczenia w fuzji z komórką gospodarza. Kiedy te wirusowe białka wiążą się z receptorami na powierzchni sąsiednich komórek, następuje fuzja komórka-komórka, w wyniku czego powstaje syncytia (wielojądrowa komórka olbrzymia).

syncytialny wirus oddechowy (RSV) jest główną przyczyną wirusowego zapalenia płuc u małych dzieci. Jego nazwa pochodzi od faktu, że może tworzyć syncytię w hodowli komórkowej, ale, co ciekawe, także w płucach zakażonych pacjentów.

zmiany w morfologii komórek związane z CPE obejmują również zaokrąglanie, odłączanie i/lub zlepianie przylegających komórek. W tym przypadku zainfekowane komórki pozostają aktywne metabolicznie w celu replikacji wirusa, ale ich cytoszkielet jest zmieniony. Zmiany morfologiczne można wyjaśnić obniżeniem ekspresji białek adhezyjnych powierzchniowych w wyniku infekcji. Na przykład wirus Ebola powoduje dramatyczne zmiany morfologiczne w przylegających komórkach poprzez zmniejszenie ekspresji integryny β1.

czy naprawdę potrzebujesz tyle dramatu (śmierć, gigantyzm, deformacja), aby uznać go za CPE? Nie. Komórki mogą po prostu” zachowywać się ” inaczej, gdy są zainfekowane, ale wyglądają tak samo. Bardziej subtelne, ale nadal jasne CPE typu zmiany mogą obejmować zmiany tempa wzrostu / kinetyki, zmiany w danej aktywności metabolicznej, lub zmiany w funkcji komórki. Wśród różnych wirusów, które mogą wywoływać tego typu CPE wyróżnia się wirus Zika. W 2015 roku wirus przenoszony przez komary był wszędzie w wiadomościach, ponieważ powoduje mikrocefalię, poważne uszkodzenie neurologiczne charakteryzujące się zmniejszoną wielkością mózgu u płodów. Później opisano, że mikrocefalia jest wynikiem kilku wywołanych przez Zika efektów cytopatycznych na komórki nerwowe, w tym przerost komórek, ograniczenie wzrostu, dysregulacja cyklu komórkowego i śmierć komórki. Na przykład użyto testu tworzenia kolonii do identyfikacji, które z różnych białek Zika zakłócają proliferację komórek.

badaczom, którzy systematycznie porównują kinetykę wzrostu linii komórkowych, polecamy Cytosmart Omni. Kinetic live-cell imaging of whole-wells, using automated scanning and image stitching software. Obraz pełny dobrze płyty dla godzin do tygodni na raz.

efekty Cytopatyczne są wynikiem interakcji wirus-gospodarz

ważne jest, aby wspomnieć, że CPE jest nie tylko zdefiniowany przez wirusa, ale także przez komórkę gospodarza. Jest to zależne od tego, jak bardzo komórki są podatne na infekcję. Będąc komórką permisywną, która może wspierać rozwój wirusa. Innymi słowy, nie wszystkie wirusy mogą zainfekować wszystkie typy komórek. Aby było to proste, możemy powiedzieć, że:

• nie permisywny wirus komórkowy nie może zainfekować
• permisywny wirus komórkowy może się replikować, ale nie powoduje oczywistego CPE
• wysoce permisywny wirus komórkowy replikuje i indukuje oczywisty CPE

więc jeśli dodasz wirusa do swoich komórek i nic się nie stanie, nie martw się. Musisz tylko znaleźć odpowiednią kombinację komórek wirusa.

odczyty – jak mierzyć CPE?

wywołane przez wirusa zmiany komórkowe, takie jak śmierć komórki lub zmieniona morfologia, są widoczne za pomocą mikroskopii świetlnej. Możesz po prostu umieścić swoją płytkę pod standardowym odwróconym mikroskopem i sprawdzić, czy twoje komórki umarły lub w jakiś sposób się zmieniły. Pozytywnym aspektem tego podejścia jest to, że jest „łatwe”, ponieważ nie wymaga żadnego przetwarzania próbki, co pozwala uniknąć utrwalania lub barwienia artefaktów.

z drugiej strony jest jakościowy, a nie ilościowy i w dużej mierze opiera się na szkoleniu obserwatora. Obecnie takie podejście można zautomatyzować, wykonując monitorowanie cytopatogenezy wywołanej wirusem w czasie rzeczywistym. Na przykład wirusowe zmiany rozprzestrzeniania się i proliferacji komórek można ocenić za pomocą testu gojenia ran, w którym można wykryć zmniejszoną prędkość migracji zbiorowej i pojedynczej komórki wraz z poważnymi zmianami w morfologii komórek. Innym podejściem ilościowym jest monitorowanie proliferacji komórek za pomocą automatycznej analizy obrazu. Dzięki tej technologii możliwe jest generowanie krzywych wzrostu zakażonych vs. niezakażone Kultury komórkowe w celu prawidłowego określenia efektu cytopatycznego, jaki może mieć infekcja wirusowa.

Jeśli komórki śmierci są tym, co czyni Twój dzień, alternatywą jest słynny Test płytki nazębnej. Ta klasyczna technika wirusologiczna jest stosowana do ilościowego oznaczania zakaźnych cząstek wirusa i opiera się na zasadzie, że wirusy mogą wywoływać lizę komórek. Po zakażeniu monowarstwy wysoce permisywnych komórek, komórki są przeciwstawiane fioletem krystalicznym (żywe komórki są kolorowe, komórki śmierci pozostają niezastąpione), w wyniku czego powstają piękne płytki (obszary komórek śmierci), które można łatwo określić ilościowo gołym okiem.

ale nie musisz widzieć swoich komórek, aby wiedzieć, że są one śmiercią. Żywotność komórek po zakażeniu można zmierzyć poprzez ilościowe określenie wewnątrzkomórkowego stężenia ATP za pomocą lucyferazy firefly lub tradycyjnego testu MTT.

praca z wirusami może być kłopotliwa, laboratoria BSL-3/4 mają ścisłe środki bezpieczeństwa, a wejście i wyjście z laboratorium zajmuje dużo czasu. Badaczom szukającym rozwiązania do monitorowania swoich komórek, bez konieczności wchodzenia do laboratorium polecamy zapoznanie się z zestawem CytoSMART Lux2 Duo.

Aplikacje

Czy twój wirus indukuje CPE? Czy możesz to wyraźnie zobaczyć lub zmierzyć? Świetnie! Możesz użyć tego CPE jako odczytu udanej infekcji wirusowej lub replikacji. Dany CPE może służyć jako wskaźnik, aby dowiedzieć się, jak zapobiegać infekcji, scharakteryzować czynniki gospodarza lub patogenu wymagane do infekcji, aby mieć miejsce, aby zidentyfikować tropizm wirusa, między innymi. W praktyce oznacza to, że może być stosowany jako odczyt dla:

• przesiewanie i ocena związku przeciwwirusowego
  czy kandydat na lek może zapobiec tworzeniu CPE?
• badania przesiewowe w kierunku przeciwciał neutralizujących
  czy dane przeciwciało może hamować CPE wywołane wirusem?
• nadzór nad opornością na leki przeciwwirusowe (fenotypowanie)
  czy dany izolat wirusa może indukować CPE w obecności leków przeciwwirusowych?
• charakterystyka tropizmu wirusowego
  które typy komórek są preferencyjnie zakażone wirusem? Dlaczego? (Sprawdź niedawną publikację z niesławnym SARS-CoV-2 w .)
• diagnostyka chorób wirusowych
  czy wirus aktywnie zaraża człowieka? Czy próbka kliniczna pobrana od tej osoby indukuje CPE? Pamiętajmy, że większość metod diagnostycznych (ELISA, RT-qPCR) nie wykrywa zakaźnych cząstek wirusa.

podsumowując…

Chociaż istnieje kilka sposobów pomiaru infekcji wirusowej, sprawdzanie CPE w komórkach permisywnych pozostaje powszechnie stosowaną alternatywą. Aby był naprawdę przydatny, musisz znaleźć odpowiednią kombinację: wirus, dopuszczalną komórkę i dokładny odczyt. Gdy znajdziesz tę kombinację, aplikacje mogą być dość zróżnicowane i przydatne w środowisku akademickim, w przemyśle lub w diagnostyce klinicznej.

Dowiedz się więcej o wszystkich rozwiązaniach do obrazowania CytoSMART tutaj