shRNA kontra siRNA
interferencja RNA (RNAi) jest procesem biologicznym, w którym cząsteczki RNA są wykorzystywane do hamowania ekspresji genów. Zazwyczaj powstają krótkie cząsteczki RNA, które są komplementarne do endogennego mRNA i po wprowadzeniu do komórek wiążą się z docelowym mRNA. Wiązanie krótkiej cząsteczki RNA z docelowym mRNA funkcjonalnie inaktywuje docelowy mRNA i czasami prowadzi do degradacji docelowego mRNA.
historycznie w zastosowaniach RNAi stosowano dwa rodzaje krótkich cząsteczek RNA. Małe interferujące RNA (siRNA) są zazwyczaj dwuniciowymi cząsteczkami RNA o długości 20-25 nukleotydów. Po transfekcji do komórek, siRNA hamują docelowy mRNA przejściowo, dopóki nie zostaną one również zdegradowane w komórce. Małe spinki do włosów RNA (shRNA) są sekwencjami RNA, zazwyczaj o długości około 80 par zasad, które zawierają region wewnętrznej hybrydyzacji, która tworzy strukturę spinki do włosów. cząsteczki shRNA są przetwarzane w komórce, tworząc siRNA, które z kolei zmniejszają ekspresję genów. Zaletą shRNA jest to, że można je włączyć do wektorów plazmidowych i zintegrować z genomowym DNA w celu uzyskania długotrwałej lub stabilnej ekspresji, a tym samym dłuższego znokautowania docelowego mRNA.
shRNA jest przetwarzany w komórce przez Exportin 5, Dicer i Kompleks RISC / AGO2. Lentiwirusowe dostarczenie shRNA umożliwia stabilną ekspresję i trwałe znokautowanie docelowego genu. (Zdjęcie Dan Cojocari ✉ · ✍ * [CC BY-SA 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0) lub GFDLhttp://www.gnu.org/copyleft/fdl.html, via Wikimedia Commons)
skuteczna ekspresja skurczów z promotorów polimerazy RNA III
Małe RNA, w tym skurcze, są transkrybowane endogennie polimerazą RNA III (Pol III). Różni się to od cDNA, które są transkrybowane przy użyciu polimerazy RNA II. dlatego, aby zagwarantować wysoką ekspresję shrna, Cellecta używa promotorów, które specyficznie wiążą promotory Pol III, U6 i H1. Zarówno promotory U6, jak i H1 działają dobrze do ekspresji wysokich poziomów shRNAacross wielu typów komórek, w porównaniu z promotorami Pol II, takimi jak CMV i EF1, które nie ekspresji shrna tak skutecznie ze względu na ich mały rozmiar. Ponadto promotory Pol II używane do ekspresji shmirów mogą nie działać w większości typów komórek, gdzie U6 i H1 działają dobrze.
Wektory Lentiwirusowe umożliwiają trwałe znokautowanie celów
shRNA staje się stabilnie zintegrowany z genomem komórki gospodarza. Gdy komórki dzielą się, shRNA jest przekazywana komórkom potomnym. Użycie wektorów lentiwirusowych do ekspresji shrna zapewnia trwałe knockdown bez konieczności wielokrotnej transfekcji komórek. Aby dowiedzieć się więcej o tym, jak działają wektory lentiviralne, zapoznaj się z naszą stroną lentiviral Vector system.
optymalizacja projektu shRNA
projektowanie efektywnych shrna jest niezbędne do skutecznego badania przesiewowego RNAi knockdown. Oprócz wyboru optymalnej sekwencji, istnieje wiele czynników strukturalnych, które wpływają na skuteczność shRNA. Ponadto struktura Spinka shrna pętli macierzystych stwarza problemy dla budowy biblioteki i wzmocnienia. Aby stworzyć reprezentatywne biblioteki shRNA o wysokiej jakości, skupiliśmy się na znacznym wysiłku, aby zoptymalizować skuteczność wstawek shRNA w naszych bibliotekach. Opracowaliśmy wewnętrzny algorytm przewidujący najskuteczniejsze sekwencje shRNA i łączymy je z opublikowanymi danymi zwalidowanych sekwencji podczas konstruowania naszych bibliotek. Zoptymalizowaliśmy również strukturę shRNA dla budowy biblioteki.
aby skutecznie testować zmiany struktury shRNA na dużą skalę, opracowaliśmy wysokoprzepustową technologię testowania skuteczności shRNA opartą na teście reporterowym. Wcześniej wykazano, że Gen reporterowy (taki jak GFP) z fuzją 3′ z fragmentem cDNA lub krótkim oligonukleotydem z genu docelowego może być skutecznie wykorzystany do monitorowania skuteczności konstrukcji siRNA i shRNA przeciwko temu genowi docelowemu. Na podstawie tych ustaleń opracowaliśmy lentiviral reporter vector do identyfikacji funkcjonalnych konstruktów shRNA (ryc. 1). Nasz opatentowany wektor reporterowy do testowania shRNA pozwala na klonowanie zarówno szablonu shRNA za promotorem H1, jak i sekwencji docelowych na 3′ końcu reportera GFP. Kiedy ten konstrukt jest transdukowany w komórkach, transkrypcja z promotora H1 wytwarza shRNA, podczas gdy transkrypcja z promotora CMV generuje transkrypt fuzyjny mRNA z wyczuciem GFP, który może być użyty jako reporter do przesiewania funkcjonalnych shrna.
Mapa konstrukcji lentywiralnego reportera shrna zintegrowanej z genomowym DNA i mechanizm knockdown reportera GFP-target. Komórki transdukowane funkcjonalnymi konstrukcjami shRNA będą miały niskie poziomy mRNA GFP, podczas gdy niefunkcjonalne shrna pozwalają na wysoki poziom ekspresji mRNA GFP.
aby zoptymalizować strukturę shRNA, skonstruowaliśmy bibliotekę shrna-target w wektorze walidacji shRNA dla 150 shrna, z których każdy shrna zbudowany jest w 40 różnych projektach opisanych w literaturze.
wykonaliśmy ekrany RNAi w komórkach cho-TRex transduced z tą biblioteką shrna-Target z kodem kreskowym 150×40 i mierzoną reprezentacją (w komórkach biblioteki i transduced) oraz wydajnością knockdown każdej konstrukcji shRNA. Poniżej przedstawiono niektóre reprezentatywne dane z tego badania przesiewowego.
dziesięć najlepszych projektów wybrano na podstawie tych, które mają najwyższą docelową aktywność knockdown, równą skuteczność wzmocnienia tego samego projektu oligonukleotydy i równe reprezentowanie tego samego projektu shrna w zbiorczych bibliotekach RNAi. Skuteczność knockdown trzech p53 shrna skonstruowanych z tych 10 najlepszych wzorów w wektorze lentiwirusowym była dalej analizowana przez RT-PCR po transdukcji do komórek fibroblastów myszy.