ARN versus siRNA

La interferencia de ARN (ARNi) es un proceso biológico en el que las moléculas de ARN se utilizan para inhibir la expresión génica. Típicamente, se crean moléculas de ARN cortas que son complementarias al ARNm endógeno y cuando se introducen en las células, se unen al ARNm objetivo. La unión de la molécula de ARN corto al ARNm objetivo inactiva funcionalmente el ARNm objetivo y a veces conduce a la degradación del ARNm objetivo.

Históricamente, se han utilizado dos tipos de moléculas de ARN cortas en aplicaciones de ARNi. El ARN de interferencia pequeño (siRNA) es típicamente moléculas de ARN de doble cadena, de 20 a 25 nucleótidos de longitud. Cuando se transfecta a las células, el siRNA inhibe el ARNm objetivo de forma transitoria hasta que también se degrada dentro de la célula. Los ARN de horquilla pequeña (ARN-shRNA) son secuencias de ARN, típicamente de unos 80 pares de bases de longitud, que incluyen una región de hibridación interna que crea una estructura de horquilla. Las moléculas de shRNA se procesan dentro de la célula para formar siRNA que a su vez derriban la expresión génica. El beneficio de los ARNm es que pueden incorporarse a vectores plásmidos e integrarse en el ADN genómico para una expresión estable o a largo plazo, y por lo tanto, una caída más prolongada del ARNm objetivo.

Expresión efectiva de ARN de Promotores de ARN Polimerasa III

Los ARN pequeños, incluidos los ARN se transcriben endógenamente con ARN Polimerasa III (Pol III). Esto es diferente de los cDNAs que se transcriben utilizando ARN polimerasa II. Por lo tanto, para garantizar una alta expresión de shRNAs, Cellecta utiliza promotores que se unen específicamente a Pol III, los promotores U6 y H1. Los promotores U6 y H1 funcionan bien para expresar altos niveles de shRNA en muchos tipos de células, en comparación con los promotores Pol II como CMV y EF1, que no expresan shRNA con la misma eficacia debido a su pequeño tamaño. Además, los promotores Pol II utilizados para expresar shMIRs pueden no funcionar en la mayoría de los tipos de células, donde U6 y H1 funcionan bien.

Los vectores Lentivirales Permiten el Derribo Permanente de Objetivos

El ARN se integra de forma estable en el genoma de la célula huésped. A medida que las células se dividen, el ARN se transmite a las células hijas. El uso de vectores lentivirales para la expresión de shRNAs proporciona una caída permanente sin necesidad de transfectar las células varias veces. Para obtener más información sobre cómo funcionan los vectores lentivirales, consulte nuestra página sistema de vectores lentivirales.

Optimización del diseño de ARN

El diseño de ARN eficaces es esencial para el cribado de derribo de ARN eficaz. Además de elegir la secuencia óptima, hay una serie de factores estructurales que afectan la eficacia del ARNr. Además, la estructura de horquilla de bucle de tallo de shRNA plantea problemas para la construcción y amplificación de bibliotecas. Para crear bibliotecas de shRNA de calidad representativa, hemos centrado un esfuerzo significativo en optimizar la eficacia de los insertos de shRNA en nuestras bibliotecas. Hemos desarrollado un algoritmo interno para predecir las secuencias shRNA más efectivas y combinarlo con datos publicados de secuencias validadas al construir nuestras bibliotecas. También hemos optimizado la estructura de shRNA para la construcción de bibliotecas.

Para probar eficientemente las variaciones de la estructura de shRNA a gran escala, desarrollamos una tecnología de prueba de eficacia de shRNA de alto rendimiento basada en un ensayo de reportero. Se demostró previamente que un gen reportero (como el GFP) con una fusión de 3′ a un fragmento de ADNc o oligonucleótido corto de un gen diana podría usarse de manera efectiva para monitorear la eficacia de las construcciones de arNIS y arNSR contra este gen diana. A partir de estos hallazgos, desarrollamos un vector reportero lentiviral para la identificación de constructos funcionales de ARN (Figura 1). Nuestro vector de reportero de prueba de shRNA patentado permite la clonación de la plantilla de shRNA aguas abajo del promotor H1 y de las secuencias de destino en el extremo 3′ del reportero GFP. Cuando este constructo se transduce a las células, la transcripción del promotor H1 produce ARNm, mientras que la transcripción del promotor CMV genera una transcripción de fusión de ARNm objetivo con sentido GFP que se puede usar como reportero para detectar ARNm funcionales.

Mapa de construcción de reportero lentiviral de objetivo shRNA integrado en el ADN genómico y mecanismo de derribo del reportero de objetivo GFP. Las células transducidas con estructuras de ARNm funcionales tendrán niveles bajos de ARNm de GFP, mientras que los ARNm no funcionales permiten un alto nivel de expresión de ARNm de GFP.

Para optimizar la estructura del shRNA, construimos una biblioteca de objetivos de shRNA en el vector de validación de shRNA para 150 shRNA, con cada shRNA construido en 40 diseños diferentes descritos en la literatura.

Realizamos pantallas RNAi en células CHO-TRex transducidas con esta biblioteca de objetivo de shRNA codificada en barras de 150×40 y representamos (en la biblioteca y las células transducidas) y la eficiencia de derribo de cada construcción de shRNA. A continuación se muestran algunos datos representativos de este análisis.

Los diez mejores diseños se seleccionaron en función de aquellos que tenían la actividad de derribo de objetivos más alta, igual eficiencia de amplificación del mismo diseño agrupado oligonucleótidos y representación equitativa de ARN del mismo diseño en las bibliotecas agrupadas de ARNI. La eficiencia de derribo de tres ARN p53 construidos con estos 10 mejores diseños en un vector lentiviral se analizó más a fondo mediante RT-PCR después de la transducción en células de fibroblastos de ratón.