shRNA versus siRNA

interferência de ARN (RNAi) é um processo biológico onde as moléculas de ARN são usadas para inibir a expressão do gene. Tipicamente, moléculas de RNA curtas são criadas que são complementares ao ARNm endógeno e quando introduzidas em células, ligam-se ao ARNm alvo. A ligação da molécula de RNA curta ao ARN-alvo inactiva funcionalmente o ARN-alvo e, por vezes, conduz à degradação do ARN-alvo.historicamente, dois tipos de moléculas de RNA curtas foram usados em aplicações RNAi. RNA interferente pequeno (siRNA) são tipicamente moléculas de RNA de cadeia dupla, 20-25 nucleótidos de comprimento. Quando transfectado em células, siRNA inibe o ARNm alvo transitoriamente até que eles também são degradados dentro da célula. O hairpin pequeno RNAs (shRNA) são sequências de RNA, tipicamente cerca de 80 pares de bases de comprimento, que incluem uma região de hibridização interna que cria uma estrutura de gancho de cabelo. moléculas de shRNA são processadas dentro da célula para formar siRNA que, por sua vez, derrubam a expressão do gene. O benefício do shRNA é que eles podem ser incorporados em vetores plasmídicos e integrados no DNA genômico para uma expressão de longo prazo ou estável, e, portanto, mais longo knockdown do ARNm alvo.

Expressão Efectiva de shRNAs Da RNA Polimerase III Promotores

Pequenos RNAs, incluindo shRNAs são transcritas endogenamente com a RNA Polimerase III (Pol III). Isto é diferente dos cDNAs que são transcritos usando RNA polimerase II. portanto, para garantir alta expressão de shRNAs, Cellecta usa promotores que ligam especificamente Pol III, os promotores U6 e H1. Tanto os promotores U6 como H1 trabalham bem para expressar altos níveis de shRNAacross muitos tipos de células, em comparação com promotores Pol II, como CMV e EF1, que não expressam shRNAs tão eficazmente devido ao seu pequeno tamanho. Além disso, os promotores Pol II utilizados para expressar shMIRs podem não funcionar na maioria dos tipos de células, onde U6 e H1 funcionam bem.os vectores lentivirais permitem a destruição permanente dos alvos

o shRNA torna-se estavelmente integrado no genoma da célula hospedeira. À medida que as células se dividem, o shRNA é passado para as células filhas. Usando Vectores lentivirais para a expressão de shRNAs fornece knockdown permanente sem necessidade de transfectar as células várias vezes. Para saber mais sobre como funcionam os vetores lentivirais, consulte a nossa página do sistema vetorial lentiviral.

a optimização do desenho de shRNA

a concepção de shRNAs eficazes é essencial para uma triagem eficaz da destruição RNAi. Além de escolher a sequência ideal, há uma série de fatores estruturais que afetam a eficácia do shRNA. Além disso, o stem-loop gancho estrutura de shRNA coloca problemas para a construção de biblioteca e de amplificação. Para criar bibliotecas shRNA de qualidade representativa, temos focado um esforço significativo para otimizar o efetivo das inserções shRNA em nossas bibliotecas. Desenvolvemos um algoritmo interno para prever as sequências de shRNA mais eficazes, e combinamos isso com dados publicados de sequências validadas ao construir nossas bibliotecas. Nós também otimizamos a estrutura do shRNA para a construção da biblioteca.para testar de forma eficiente as variações da estrutura de shRNA em larga escala, desenvolvemos uma tecnologia de teste de eficácia shRNA de alta produtividade com base num ensaio de repórter. Ele foi previamente demonstrado que um gene repórter (como GFP), com 3′ de fusão para um fragmento de cDNA ou curto oligonucleotide a partir de um gene alvo pode ser efetivamente usado para monitorar a eficácia de siRNA e shRNA construções contra este gene alvo. Com base nestes achados, desenvolvemos um vetor repórter lentiviral para identificação de construções de shRNA funcionais (Figura 1). Nossa propriedade shRNA testing reporter vector permite a clonagem de ambos os modelos shRNA a jusante do promotor H1 e sequências de alvo na extremidade 3′ do Repórter GFP. Quando esta construção é transduzida em células, a transcrição do promotor H1 produz shRNA, enquanto a transcrição do promotor CMV gera uma transcrição de fusão mRNA de Sentido GFP que pode ser utilizada como repórter para a triagem de shRNAs funcionais.

Map of shRNA-target lentiviral reporter construct integrated in genomic DNA and mechanism of knockdown of GFP-target reporter. As células transdutadas com construções de shRNA funcionais terão baixos níveis de mRNA GFP, enquanto os shRNAs não funcionais permitem um alto nível de expressão de mRNA GFP.

para otimizar a estrutura do shRNA, nós construímos uma biblioteca shRNA-alvo no vetor de validação shRNA para 150 shRNAs, com cada shRNA construído em 40 projetos diferentes descritos na literatura.

realizamos telas RNAi em células CHO-TRex transduced com esta biblioteca shRNA-alvo de 150×40 bar-codificado e representação medida (na biblioteca e células transdutidas) e eficiência de knockdown de cada construção shRNA. Alguns dados representativos desta triagem são mostrados abaixo.

Os dez melhores projetos foram escolhidos de acordo com aqueles que têm o maior alvo queda de atividade, de igual eficiência da amplificação do mesmo projeto de pool de oligonucleotídeos, e a igualdade de representação do mesmo projeto de shRNAs no pool de RNAi bibliotecas. A eficiência de knockdown de três shRNAs p53 construídos com estes 10 melhores projetos em um vetor lentiviral foi posteriormente analisada pela RT-PCR após transdução em células fibroblastas do mouse.