Qual é a diferença entre uma mancha meridional, Setentrional e ocidental?

diferentes técnicas de coagulação são utilizadas para identificar proteínas únicas e sequências de ácidos nucleicos. Protocolos sul, norte e oeste de blot são similares, e começam com separação eletroforética de fragmentos de proteína e ácido nucleico em um gel, que são então transferidos para uma membrana (membrana nitrocelulose, Difluoreto de polivinilideno (PVDF), etc.) onde estão imobilizados. Isto permite que anticorpos ou sondas de DNA marcados por radiação ou enzimaticamente para ligar o alvo imobilizado, e as moléculas de interesse podem então ser visualizadas com vários métodos. As técnicas de coagulação são selecionadas com base na molécula-alvo: DNA, RNA ou proteína. (Figura 1, Quadro 1).

Southern Blot

Southern blots are used to determine the identity, size, and abundance of specific DNA sequences. O protocolo southern blot começa com a extração de DNA das células ou tecidos, que é então digerido enzimaticamente para produzir fragmentos de DNA. Os fragmentos são separados por tamanho num gel de agarose ou poliacrilamida por electroforese. Fragmentos menores migram mais para o gel do que para os maiores. Após a electroforese, o ADN no gel é transferido para uma membrana de nylon. A membrana é incubada com uma sonda de ácido nucleico que tem uma sequência homóloga para a sequência-alvo e é rotulada com radioatividade, corante fluorescente, ou uma enzima capaz de gerar um sinal quimioluminescente. Hibridização de sequências complementares ocorre durante a incubação,e a sonda não-hibridizada é removida por lavagem com tampão. As moléculas da sonda totalmente hibridizadas ficarão ligadas à mancha. Os métodos de detecção diferem com base no rótulo da sonda; sondas radiolabeladas são visualizadas com filme de raios X ou fosforimagem, e sondas enzimaticamente marcadas são visualizadas com substrato quimioluminescente. isolamento do ADN da digestão por restrição: digestão do ADN com uma enzima de restrição e, se necessário, concentrado ADN digerido.electroforese em Gel: preparar um gel de agarose e um tampão TAE ou TBE (a selecção do tampão dependerá da duração da corrida e do tamanho dos fragmentos de ADN). Carregar amostras em poços e incluir um marcador de peso molecular de ADN. Põe o gel.transferência: colocar o gel num recipiente com solução de desnaturação e lavar duas vezes durante 15 minutos num agitador.lave com água e depois lave com uma solução de neutralização.durante a etapa anterior, comece a preparar o papel Whatman e a membrana de nylon para a transferência.juntar o aparelho de transferência com a membrana, o papel Whatman e o gel e transferir em tampão SSC ou SSPE.quando a transferência estiver completa, o ADN de ligação cruzada num linker cruzado e, em seguida, enxaguar a membrana.

pré-hibridação (bloqueio):o bloqueio de

• reduz a ligação não específica à membrana. Preparar a solução de pré-hibridação e adicionar amostra de ADN. Remover a mancha do linker cruzado, adicionar a solução de pré-hibridação e incubar.hibridização:
  • preparar a mistura de sonda (uma cadeia complementar de ADN) e tampão.
  • remova a solução de pré-hibridação e incube a mancha com a sonda (os tempos de incubação variam dependendo da aplicação).após a incubação, efectuar uma lavagem de baixa resistência seguida de uma lavagem de alta resistência para refinar o ADN.detecção da sonda:lavar a membrana, transferir para um recipiente com solução de bloqueio e incubar.solução bloqueadora de devoluções, substituir por solução de anticorpos e incubar.eliminar a solução de anticorpos, lavar a membrana.siga as instruções do fabricante para detecção quimioluminescente.

  Northern Blot

  Northern blots are used to determine the identity, size, and abundance of specific RNA sequences. Os protocolos Northern blot começam com o isolamento do RNA, e as técnicas de separação variam dependendo do tamanho do RNA. As RNAs grandes são separadas por electroforese num gel de agarose de formaldeído ou gel de agarose glioxal, o que impede a preparação normal da base e mantém o ARN num estado desnaturado. As RNAs pequenas são separadas num gel de poliacrilamida (ureia) desnaturante. O RNA é então transferido do gel para uma membrana de nylon que é então incubada com uma sonda radioativa ou não-isotopicamente marcada RNA, DNA ou oligodeoxinucleótido. A sonda não-hidratada é removida por lavagem com tampão. Sondas radiolabeladas são visualizadas com filme de raios-X, e sondas enzimaticamente rotuladas são visualizadas com quimioluminescência.isolamento de ARN

electroforese:

• para um gel de agarose de formaldeído: preparar o gel e inserir o tabuleiro de gel no aparelho. Encher com tampão de esfregões, carregar as amostras e incluir um marcador de peso molecular. Passe o gel, depois apare o gel antes de borrifar.para um gel de agarose glioxal: preparar o gel e inserir o tabuleiro de gel no aparelho. Encher com tampão de esfregões, preparar amostras e carregar em poços juntamente com escada de ARN.para um gel de poliacrilamida desnaturante: castrar o gel e montá-lo na unidade de electroforese. Preparar amostras, carregar no gel, e correr com o tampão de correr do TBE.transferência: para um gel de agarose de formaldeído ou gel de agarose glioxal: lavar o gel em SSC, depois montar a unidade de transferência com o gel, o papel de filtro e a membrana de nylon. Quando a transferência estiver completa, coloque a membrana num revestimento cruzado UV.para um gel de poliacrilamida desnaturante: montar a unidade de transferência, incluindo gel, papel filtrante e membrana de nylon, assegurando que são inundados com TBE. Quando a transferência estiver completa, coloque a membrana num revestimento cruzado UV para fixar o ARN à membrana.

pré-hibridação (bloqueio):

• pré-hibridação da membrana em solução de hibridação.

hibridação:

• adicionar sonda à solução de hibridação e incubar.lavar a membrana em lavagens de baixa resistência para remover a solução de hibridação e a sonda não-hidratada, e lavagem de alta resistência para remover moléculas parcialmente hibridadas.siga as instruções do fabricante para detecção quimioluminescente.

Western Blot

Western blots são usados para determinar a identidade, o tamanho e a abundância de proteínas específicas dentro de uma amostra. O protocolo western blot começa com a preparação de lisato de amostra de cultura de tecidos ou células e separação num gel de poliacrilamida através de electroforese. As proteínas separadas são então transferidas para uma membrana nitrocelulose ou Difluoreto de polivinilideno (PVDF). A membrana é incubada com um agente bloqueador para prevenir a ligação não específica, seguido de incubação com um anticorpo primário para ligar a proteína de interesse. Existem dois métodos de detecção, direta e indireta. A detecção direta (Figura 2) baseia-se num anticorpo primário rotulado, enquanto que a detecção indireta requer um anticorpo primário dirigido contra a proteína alvo, e um anticorpo secundário dirigido contra a classe de imunoglobina ou subclasse da espécie de anticorpo primário (Figura 3). Os métodos de visualização incluem ensaios colorimétricos em que um precipitado colorido é produzido, quimioluminescência e fluorescência.

Protocolo Western blot

1. preparar lisato a partir da cultura celular ou do tecido.
2. preparação da amostra:
   • determina a concentração de proteínas de cada amostra com um ensaio de quantificação de proteínas (ie. Bradford assay).adicionar um volume igual de tampão de amostras de 2x Laemmli a cada amostra.algumas amostras podem necessitar de ser reduzidas ou desnaturadas, o que é conseguido através da ebulição de amostras em tampão de choque.electroforese: preparar um gel de página SDS, carregar amostras juntamente com um marcador de peso molecular.
   • execute o gel em tampão de correr.transferência: após a electroforese, montar a unidade de transferência incluindo a membrana gel, PVDF ou nitrocelulose e o papel de filtro.transferir as proteínas para a membrana com tampão de transferência.
3. coloração de anticorpos (detecção indirecta):
   • preparar tampão de bloqueio e incubar a membrana para reduzir a ligação não específica.incubar a membrana com anticorpos primários diluídos em tampão de bloqueio.lavar a membrana em TBST e incubar com anticorpos secundários conjugados diluídos em tampão de bloqueio.lavar a membrana em TBST.siga as instruções do fabricante para detecção quimioluminescente.