shRNA versus siARN

interferența ARN (RNAi) este un proces biologic în care moleculele de ARN sunt utilizate pentru a inhiba expresia genelor. De obicei, sunt create molecule scurte de ARN care sunt complementare ARNm endogen și, atunci când sunt introduse în celule, se leagă de ARNm țintă. Legarea moleculei de ARN scurt la ARNm țintă inactivează funcțional ARNm țintă și uneori duce la degradarea ARNm țintă.din punct de vedere istoric, două tipuri de molecule scurte de ARN au fost utilizate în aplicațiile RNAi. ARN-ul interferent mic (siRNA) sunt de obicei molecule de ARN dublu catenar, cu o lungime de 20-25 nucleotide. Când sunt transfectate în celule, siARN inhibă ARNm țintă tranzitoriu până când acestea sunt, de asemenea, degradate în interiorul celulei. ARN-urile mici de ac de păr (shRNA) sunt secvențe de ARN, de obicei aproximativ 80 de perechi de baze în lungime, care includ o regiune de hibridizare internă care creează o structură de ac de păr. moleculele shRNA sunt procesate în interiorul celulei pentru a forma siARN care, la rândul său, doboară expresia genelor. Beneficiul shRNA este că acestea pot fi încorporate în vectori plasmidici și integrate în ADN genomic pentru o expresie pe termen lung sau stabilă și, astfel, o eliminare mai lungă a ARNm țintă.

expresia efectivă a ARNr de la promotorii ARN polimerazei III

ARN-urile mici, inclusiv ARNr-urile, sunt transcrise endogen cu ARN polimeraza III (Pol III). Acest lucru este diferit de CDN-urile care sunt transcrise folosind ARN polimeraza II. prin urmare, pentru a garanta o expresie ridicată a shrn-urilor, Cellecta folosește promotori care leagă în mod specific Pol III, promotorii U6 și H1. Atât promotorii U6, cât și H1 funcționează bine pentru a exprima niveluri ridicate de shRNA în multe tipuri de celule, în comparație cu promotorii Pol II, cum ar fi CMV și EF1, care nu exprimă shRNA la fel de eficient datorită dimensiunilor mici. În plus, promotorii Pol II utilizați pentru exprimarea shMIRs pot să nu funcționeze în majoritatea tipurilor de celule, unde U6 și H1 funcționează bine.

vectorii Lentivirali permit eliminarea permanentă a țintelor

shRNA devine integrat stabil în genomul celulei gazdă. Pe măsură ce celulele se divid, shRNA este transmis celulelor fiice. Utilizarea vectorilor lentivirali pentru exprimarea shRNAs oferă o eliminare permanentă fără a fi nevoie să transfectați celulele de mai multe ori. Pentru a afla mai multe despre modul în care funcționează vectorii lentivirali, consultați pagina noastră Sistem Vector lentiviral.

optimizarea shRNA Design

proiectarea shRNA eficiente este esențială pentru screening-ul eficient knockdown RNAi. Pe lângă alegerea secvenței optime, există o serie de factori structurali care afectează eficacitatea shRNA. În plus, structura acului cu buclă de tulpină a shRNA pune probleme pentru construcția și amplificarea bibliotecii. Pentru a crea biblioteci shRNA de calitate reprezentative, ne-am concentrat eforturi semnificative pentru a optimiza eficient inserțiilor shRNA în bibliotecile noastre. Am dezvoltat un algoritm intern pentru a prezice cele mai eficiente secvențe shRNA și combinăm acest lucru cu datele publicate ale secvențelor validate atunci când construim bibliotecile noastre. De asemenea, am optimizat structura shRNA pentru construcția bibliotecii.

pentru a testa eficient variațiile structurii shRNA pe scară largă, am dezvoltat o tehnologie de testare a eficacității shRNA cu randament ridicat, bazată pe un test reporter. S-a demonstrat anterior că o genă reporter (cum ar fi GFP) cu o fuziune de 3′ la un fragment ADNc sau oligonucleotidă scurtă dintr-o genă țintă ar putea fi utilizată în mod eficient pentru a monitoriza eficacitatea siARN și shRNA construiește împotriva acestei gene țintă. Pe baza acestor constatări, am dezvoltat un vector lentiviral reporter pentru identificarea constructelor funcționale shRNA (Figura 1). Vectorul nostru proprietar de reporter de testare shRNA permite clonarea atât a șablonului shRNA în aval de promotorul H1, cât și a secvențelor țintă la capătul 3′ al reporterului GFP. Când acest construct este transdus în celule, transcrierea de la promotorul H1 produce shRNA, în timp ce transcrierea de la promotorul CMV generează o transcriere de fuziune a ARNm țintă GFP-sense care poate fi utilizată ca reporter pentru screeningul shRNA-urilor funcționale.

harta shRNA-țintă lentiviral reporter construct integrat în ADN-ul genomic și mecanismul de knockdown al GFP-țintă reporter. Celulele transduse cu constructe funcționale shRNA vor avea niveluri scăzute de ARNm GFP, în timp ce ARN-urile nefuncționale permit un nivel ridicat de exprimare a ARNm GFP.

pentru a optimiza structura shRNA, am construit o bibliotecă țintă shRNA în vectorul de validare shRNA pentru 150 shRNA, fiecare shRNA fiind construit în 40 de modele diferite descrise în literatură.

am realizat ecrane RNAi în celule CHO-TRex transduse cu această bibliotecă țintă shRNA codificată cu bare 150×40 și reprezentare măsurată (în bibliotecă și celule transduse) și eficiența de eliminare a fiecărui construct shRNA. Unele date reprezentative din acest screening sunt prezentate mai jos.

cele mai bune zece modele au fost selectate pe baza celor care au cea mai mare activitate de eliminare a țintei, eficiență de amplificare egală a aceluiași design oligonucleotide și reprezentare egală a shRNA-urilor cu același design în bibliotecile rnai reunite. Eficiența de eliminare a trei shRNA-uri p53 construite cu aceste 10 cele mai bune modele într-un vector lentiviral a fost analizată în continuare de RT-PCR după transducție în celule fibroblaste de șoarece.