care este diferența dintre o pată sudică, nordică și Occidentală?

diferite tehnici de blotting sunt folosite pentru a identifica proteinele unice și secvențele de acid nucleic. Protocoalele Southern, northern și western blot sunt similare și încep cu separarea electroforetică a fragmentelor de proteine și acid nucleic pe un gel, care sunt apoi transferate într-o membrană (membrană de nitroceluloză, membrană de difluorură de poliviniliden (PVDF) etc.) în cazul în care acestea sunt imobilizate. Acest lucru permite sondelor de anticorpi sau ADN marcate radioactiv sau enzimatic să lege ținta imobilizată, iar moleculele de interes pot fi apoi vizualizate prin diferite metode. Tehnicile de ștergere sunt selectate pe baza moleculei țintă: ADN, ARN sau proteine. (Figura 1, Tabelul 1).

Southern Blot

Southern blot sunt folosite pentru a determina identitatea, dimensiunea și abundența secvențelor ADN specifice. Protocolul Southern blot începe cu extragerea ADN-ului din celule sau țesuturi, care este apoi digerat enzimatic pentru a produce fragmente de ADN. Fragmentele sunt separate prin mărime pe un gel de agaroză sau poliacrilamidă prin electroforeză. Fragmente mai mici vor migra mai departe pe gel decât cele mai mari. După electroforeză, ADN-ul de pe gel este transferat într-o membrană din nailon. Membrana este incubată cu o sondă de acid nucleic care are o secvență omologă cu secvența țintă și este etichetată cu radioactivitate, colorant fluorescent sau o enzimă capabilă să genereze un semnal chemiluminescent. Hibridizarea secvențelor complementare are loc în timpul incubării, iar sonda nehidridizată este îndepărtată prin spălare cu tampon. Moleculele sondei etichetate complet hibridizate vor rămâne legate de pată. Metodele de detectare diferă în funcție de eticheta sondei; sondele radiomarcate sunt vizualizate cu film de raze X sau fosforimagistică, iar sondele etichetate enzimatic sunt vizualizate cu substrat chemiluminescent.

protocolul Southern blot

1. izolarea ADN-ului
2. restricție digestie: digerați ADN-ul cu o enzimă de restricție și, dacă este necesar, concentrați ADN-ul digerat.
3. electroforeza în Gel: pregătiți un gel de agaroză și tampon TAE sau TBE (selecția tamponului va depinde de durata alergării și de dimensiunea fragmentelor de ADN). Încărcați probele în puțuri și includeți un marker de greutate moleculară ADN. Rulați gelul.
4. Transfer:
   • puneți gelul într-un recipient cu soluție de denaturare și spălați de două ori timp de 15 minute pe un agitator.
   • clătiți cu apă, apoi spălați cu soluție de neutralizare.
   • în timpul etapei anterioare, începeți să pregătiți hârtia Whatman și membrana de nailon pentru transfer.
   • asamblați aparatul de transfer cu membrana, hârtia Whatman și gelul și transferați în tampon SSC sau SSPE.
   • când transferul este complet, ADN-ul de legătură încrucișată într-o legătură încrucișată, apoi clătiți membrana.
5. pre-hibridizare (blocare):
   • blocarea reduce legarea nespecifică la membrană. Pregătiți soluția de pre-hibridizare și adăugați ADN de probă. Scoateți blotul din linia încrucișată, adăugați soluția de pre-hibridizare și incubați.
6. hibridizare:
   • pregătiți amestecul sondei (o catenă ADN complementară) și tamponul.
   • îndepărtați soluția de pre-hibridizare și incubați pata cu sonda (timpii de incubație vor varia în funcție de aplicație).
   • după incubare, efectuați o spălare cu stringență redusă urmată de o spălare cu stringență ridicată pentru a rafina ADN-ul.
7. detectarea sondei:
   • clătiți membrana, transferați într-un recipient cu soluție de blocare și incubați.
   • aruncați soluția de blocare, înlocuiți-o cu soluție de anticorpi și incubați.
   • aruncați soluția de anticorpi, spălați membrana.
8. Urmați instrucțiunile producătorului pentru detectarea chemiluminiscentă.

Northern Blot

Northern blots sunt utilizate pentru a determina identitatea, dimensiunea și abundența secvențelor specifice de ARN. Protocoalele Northern blot încep cu izolarea ARN, iar tehnicile de separare variază în funcție de dimensiunea ARN. ARN-urile mari sunt separate prin electroforeză pe un gel de agaroză de formaldehidă sau gel de agaroză glioxal, care împiedică pararea normală a bazei și menține ARN-ul într-o stare denaturată. ARN-urile mici sunt separate pe un gel de poliacrilamidă denaturat (uree). ARN-ul este apoi transferat din gel într-o membrană de nailon care este apoi incubată cu o sondă ARN, ADN sau oligodeoxinucleotidă marcată radioactiv sau nonizotopic. Sonda nehidridizată este îndepărtată prin spălare cu tampon. Sondele radiomarcate sunt vizualizate cu film cu raze X, iar sondele etichetate enzimatic sunt vizualizate cu chemiluminescență.

Protocolul Northern blot

1. izolarea ARN
2. electroforeză:
   • pentru un gel de agaroză în formaldehidă: pregătiți gelul și introduceți tava de gel în aparat. Umpleți cu tampon MOPS, încărcați probele și includeți un marker de greutate moleculară. Rulați gelul, apoi tăiați gelul înainte de a șterge.
   • pentru un gel de agaroză glioxal: pregătiți gelul și introduceți tava de gel în aparat. Umpleți cu tampon de mopuri, pregătiți probe și încărcați în puțuri împreună cu scara ARN.
   • pentru un gel de poliacrilamidă denaturat: aruncați gelul și montați-l în unitatea de electroforeză. Pregătiți probe, încărcați în gel și rulați cu tampon de rulare TBE.
3. Transfer:
   • pentru un gel de agaroză formaldehidă sau gel de agaroză glioxal: spălați gelul în SSC, apoi asamblați unitatea de transfer cu gel, hârtie de filtru și membrană din nailon. Când transferul este complet, așezați membrana într-un cross-linker UV.
   • pentru un gel de poliacrilamidă denaturat: asamblați unitatea de transfer, inclusiv gel, hârtie de filtru și membrană din nailon, asigurându-vă că acestea sunt inundate cu TBE. Când transferul este complet, așezați membrana într-o legătură încrucișată UV pentru a fixa ARN-ul pe membrană.
4. Pre-hibridizare (blocare):
   • pre-hibridizarea membranei în soluție de hibridizare.
5. hibridizare:
   • adăugați sonda la soluția de hibridizare și incubați.
   • spălați membrana în spălări cu stringență redusă pentru a îndepărta soluția de hibridizare și sonda nehidridizată și spălări cu stringență ridicată pentru a îndepărta moleculele parțial hibridizate.
   • Urmați instrucțiunile producătorului pentru detectarea chemiluminiscentă.

Western Blot

Western blots sunt utilizate pentru a determina identitatea, dimensiunea și abundența proteinelor specifice dintr-o probă. Protocolul western blot începe cu prepararea lizatului de probă din cultura tisulară sau celulară și separarea pe un gel de poliacrilamidă prin electroforeză. Proteinele separate sunt apoi transferate într-o membrană de nitroceluloză sau difluorură de poliviniliden (PVDF). Membrana este incubată cu un agent de blocare pentru a preveni legarea nespecifică, urmată de incubarea cu un anticorp primar pentru a lega proteina de interes. Există două metode de detectare, directe și indirecte. Detectarea directă (Figura 2) se bazează pe un anticorp primar marcat, în timp ce detectarea indirectă necesită un anticorp primar îndreptat împotriva proteinei țintă și un anticorp secundar îndreptat împotriva clasei sau subclasei de imunoglobină a speciei anticorpului primar (Figura 3). Metodele de vizualizare includ teste colorimetrice în care se produce un precipitat colorat, chemiluminescență și fluorescență.

Protocolul Western blot

1. se prepară lizat din culturi celulare sau țesuturi.
2. pregătirea probei:
   • determinați concentrația proteică a fiecărei probe cu un test de cuantificare a proteinelor (adică. Testul Bradford).
   • adăugați un volum egal de 2x tampon de probă Laemmli la fiecare probă.
   • este posibil ca unele probe să fie reduse sau denaturate, acest lucru se realizează prin fierberea probelor în tampon.
3. electroforeză:
   • pregătiți un gel SDS-PAGE, încărcați probe împreună cu markerul de greutate moleculară.
   • rulați gelul în tamponul de rulare.
4. Transfer:
   • după electroforeză, asamblați unitatea de transfer incluzând membrana de gel, PVDF sau nitroceluloză și hârtia de filtru.
   • transferați proteinele în membrană cu tampon de transfer.
5. colorarea anticorpilor (detectare indirectă):
   • pregătiți tamponul de blocare și incubați membrana pentru a reduce legarea nespecifică.
   • se incubează membrana cu anticorp primar diluat în tampon de blocare.
   • spălați membrana în TBST și incubați cu anticorp secundar conjugat diluat în tampon de blocare.
   • spălați membrana în TST.
   • Urmați instrucțiunile producătorului pentru detectarea chemiluminiscentă.