endotel

hornhinnans endotel utgör det innersta lagret av hornhinnan och separerar det från vattenhuman i ögans främre kammare (Fig. 61.1). Endotelet består av ett enda lager (ungefär 4 MICR) av skivepitelceller, som kännetecknas av det distinkta uttrycket av jonpumpar såsom Na+/K+/ATPas och tätt korsningsprotein såsom ZO-1 (Tabell 61.1). Detta skikt fungerar som en barriär för att upprätthålla det korrekta hornhinnans uttorkningstillstånd via en pumpläckagemekanism .

förlust eller dysfunktion av hornhinnans endotelceller (CECs) skapar överskott av vätskeuppbyggnad i hornhinnan, vilket resulterar i progressiv svullnad, stromal desorganisation, minskad transparens och nedsatt syn . De främsta orsakerna till endotelförlust i hornhinnan och dysfunktion är endoteldystrofi, trauma/kirurgi eller kronisk främre uveit. Fuchs endotelkorneal dystrofi och medfödd ärftlig endoteldystrofi är bland de vanligaste endoteldystrofierna i hornhinnan orsakade av genetiska mutationer och potentiella miljöfaktorer . En annan vanlig orsak till endoteldystrofi, pseudofakisk bullös keratopati, induceras av skada på endotelet under kataraktoperation. Diabetes och åldrande är också betydande riskfaktorer för endotelförlust i hornhinnan.

Till skillnad från epitelceller som kan reparera genom proliferation har vuxna CECs begränsad proliferativ kapacitet. Istället tenderar endotelceller att reparera genom att glida mot området för skada och utvidgning av intilliggande celler. Även om denna mekanism upprätthåller hornhinnans endotelbarriär efter skada, minskar den också endotelcellens densitet och förändrar deras sexkantiga morfologi och pumpkapacitet. När minskningen i celldensitet når ett intervall på 500-1000 celler / mm2 eller mindre är det enda tillgängliga terapeutiska alternativet partiell eller fullständig hornhinnetransplantation . För närvarande står hornhinnetransplantation för endotelförlust för 60% av alla hornhinnetransplantationer som utförs i USA .

för att övervinna den ovan beskrivna hornhinnevävnadsdonatorbristen har initiala ansträngningar fokuserat på isolering och ex vivo-expansion av primära CECs. Den första framgångsrika kulturen av mänskliga CECs rapporterades 1965 . Sedan dess har flera modifieringar i isoleringstekniker, extracellulära matrissubstrat och odlingsmedier utvecklats för att övervinna cellernas begränsade förökningskapacitet och förlusten av CEC-fenotypen i odling . Till exempel, Okumura et al. undersökte uttrycket av olika lamininisoformer i hornhinnan och identifierade laminin-511 och 521 som de dominerande lamininformerna i vuxen DM . Genom att använda dessa två lamininer som ett substrat för in vitro-kulturen av mänskliga CECs lyckades de avsevärt förbättra bindningen, överlevnaden och expansionen av CECs . Andra grupper har försökt odla mänskliga CECs på mänskliga donator-härledda dm som substrat. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att det efterliknar hornhinnemiljön in vivo för att uppnå korrekt CEC-underhåll och tillväxt . Betydelsen av DM för att stödja CEC-expansion bekräftades också av en nyligen genomförd studie utförd i en kaninkorneal endotelskademodell. Genom detta demonstrerades att frånvaron av DM försämrade nativ CEC-migration och hornhinneregenerering .

trots fördelarna komplicerar användningen av byggnadsställningar leverans i hornhinnan, vilket kräver detaljerade kirurgiska ingrepp. Ett mycket enklare tillvägagångssätt skulle vara att leverera CECs i cellsuspension. Injektionen av celler i suspension skulle möjliggöra enklare tillverkningsmetoder och teoretiskt vara mindre invasiv . Detta tillvägagångssätt ökar emellertid risken för avlägsnande av injicerade celler genom flödet av vattenhaltig humor, vilket begränsar cellöverlevnad och engraftment i hornhinnan. Två metoder som utvecklats för att förbättra leveransen av cellsuspensioner i hornhinnans endotel inkluderar användningen av magnetfältstyrd leverans och myntsprutning av celler med en BERGHÄMMARE. För magnetisk cellleverans märks CECs med magnetiska partiklar och levereras till lämplig plats på den bakre hornhinnans yta med hjälp av en extern magnet . I ett nytt exempel märktes CECs med superparamagnetiska nanopartiklar och injicerades i den främre okulära kammaren hos vuxna kaniner med CEC-skada. På samma sätt som infödda CEC bildade de injicerade cellerna ett monolager och återställde hornhinnans transparens utan några negativa effekter . Alternativt, Okumura et al. används coinjection av CECs med BERGHÄMMAREN Y27632 för att förbättra CEC överlevnad och proliferation. Detta tillvägagångssätt resulterade i bättre engraftment av cellerna och förbättrad återhämtning av hornhinnans transparens i en kaninmodell av hornhinneskada . Dessa hälsosamma effekter bekräftades i en apa-modell av endoteldystrofi i hornhinnan , vilket ledde till initiering av humana kliniska studier. I 2018 rapporterade samma grupp resultaten av transplantation av CECs, i kombination med ROCKHÄMMARE, hos 11 patienter med bullous keratopati; mer än 80% av de behandlade patienterna visade återhämtning av hornhinnans tjocklek och förbättrad synskärpa 24 veckor efter behandling . Denna studie gav det första kliniska beviset att den minimalt invasiva transplantationen av odlade humana CECs kan användas som ett nytt terapeutiskt alternativ för att behandla endoteldysfunktion i hornhinnan. Samtidigt väckte det frågor om den framtida utvecklingen av detta tillvägagångssätt. Dessa inkluderar behovet av att bestämma ett lämpligt donatoråldersintervall för produktion av högkvalitativa transplanterbara CECs, det mekanistiska bidraget från BERGHÄMMARE till de kliniska resultaten, den exakta doseringen av celler för att balansera effekt och säkerhet och utvecklingen av ett sätt att spåra ödet för levererade celler efter transplantation . Dessutom pausar den begränsade tillgängligheten av högkvalitativa donator-CECs och cellernas begränsade kapacitet att expandera in vitro några betydande utmaningar för den kliniska översättningen av detta tillvägagångssätt.

av denna anledning har flera grupper försökt generera CEC-liknande celler från alternativa stamcellskällor, såsom MSC, hud-härledda celler, hornhinnestromala celler och PSC . Dessa studier tillämpade vår nuvarande förståelse för embryonal utveckling av CECs genom att isolera förmodade CEC-stamfaderpopulationer, såsom NCC, Från primära celler och differentiera dem till mer mogna CEC-liknande celler. Till exempel isolerades och odlades hornhinnestromaceller och hud-härledda prekursorer innehållande NCC i närvaro av retinsyra och GSK-3-hämmare (Wnt-signaleringsvägaktivator) för att inducera CEC-liknande celler. Dessa celler visade uppreglering av Pitx2, en nyckeltranskriptionsfaktor för utvecklingen av det främre ögonsegmentet, liksom uppreglering av CEC-markörerna Atp1a1 och Cdh2. Det är viktigt att cellerna uppvisade funktionella egenskaper hos CEC, såsom pumpfunktion. När cellerna transplanterades med hjälp av ett kollagenark som bärare återställde de synen i en kaninmodell av keratopati . Med hjälp av ett liknande tillvägagångssätt, Shen et al. differentierade hud-härledda prekursorer genom coculturing med B4G12, en odödlig mänsklig CEC-linje. Inom 1 vecka av differentiering uppvisade cellerna markerat uttryck av typiska CEC-markörer. Transplantation av dessa celler resulterade i framgångsrik återhämtning av hornhinnans tjocklek och hornhinnans transparens i både kanin-och apmodeller av hornhinnans endoteldystrofi .

NCC kan också genereras in vitro från PSC, som erbjuder en obegränsad och expanderbar cellkälla för klinisk tillämpning. Zhang et al. rapporterade differentieringen av mänskliga Esc till periokulära mesenkymala prekursorceller (POMPs), en subtyp av NCC, genom transwell coculture med humana hornhinnestromala celler. Dessa inducerade Pomper odlades i konditionerade medier från linsepitelceller, och differentiering bekräftades genom att testa genuttrycket av typiska CEC-markörer såsom N-Cadherin, FoxC1 och PITX2. För att berika för CEC-liknande celler sorterades cellerna sedan och såddes på en decellulariserad porcin hornhinnematris följt av framgångsrik transplantation och induktion av hornhinnereparation till en kaninmodell av hornhinnedystrofi .

för att undvika användning av xenogent material från decellulariserade hornhinnor använder de senaste metoderna små molekylföreningar och xenofria tillväxtfaktorer för att inducera CEC-cellens öde. Flera grupper har till exempel visat differentiering av PSC till NCC efter inhiberingen av TGF-vägen för TGF/SMAD . Dessa NCC: er odlades sedan i media innehållande PDGF-BB och Dkk2, vilket inducerade cellerna att förvärva det sexkantiga utseendet och uttrycka molekylära markörer för CEC-celler . Det är viktigt att cellerna kan deponera kollagen som genererar en in vitro-genererad DM och uttryckte huvudkomponenter i hornhinnans endotelpumpfunktion såsom Na+K+ATPasea1 . Även om det är lovande väntar den funktionella aspekten av dessa PSC-härledda CEC-liknande celler ytterligare undersökning. Några kritiska framtida frågor inkluderar förmågan hos dessa PSC-härledda CEC – liknande celler att fungera som en läckande barriär och upprätthålla hornhinnans uttorkningstillstånd, liksom utforskningen av deras terapeutiska potential in vivo.