fem pax-6-varianter och deras uttrycksmönster i bläckfiskembryon och vuxna ögonvävnader

Vi utförde en enda 3′-ras PCR för pygmy squid Pax-6-genen (betecknad som ippax-6) för att undersöka skarvningsvarianterna och flera loci av Pax-6 i coleoid bläckfiskar. Vi fann att det inte fanns några flera loci i pygmy squid, men vi identifierade tre pax-6-varianter av diskreta längder. Skillnader i aminosyrasekvenserna bland dessa pax-6-varianter begränsades till begränsade regioner. Därför antogs de vara resultatet av alternativa skarvningshändelser i ett enda ställe. Vi validerade därefter närvaron av skarvningsvarianter med RT-PCR och vi fick slutligen fem typer av skarvningsvarianter, inklusive en uppenbar ortholog av autentisk Pax-6 (figur 1). Längden och strukturen hos autentiska ippax-6 liknade de hos Pax-6-generna som finns i andra bläckfiskarter, Euprymna scolopes och Loligo pealei15,16. Autentisk ippax-6 (autentisk form, 499 aa) består av två oberoende DNA-bindande domäner, PD-och HD-domänerna och en C-terminal P/S/T-rik domän (PST), som är den dedikerade aktivatorn med ett partnertransaktivatorprotein, som visas hos många djur (figur 1). Både proteinsekvenslikhet och det fylogenetiska trädet bekräftade att ippax-6 var en ortholog av fly ey och vertebrate Pax-4/6 (kompletterande figur 1). De fyra identifierade varianterna producerade proteiner med längder som skiljer sig från den för autentisk ippax-6 (figur 1).

för att utforska det scenspecifika uttrycket för squid Pax-6-varianterna utförde vi Q-PCR för olika vävnader och vid olika embryonala stadier med primers utformade för att rikta in sig på ytterligare exoner av IpPax-6 (figur 2 & figur S2). Bläckfiskägg visar epibolisk gastrulation och direkt utveckling utan typiska blötdjurslarvstadier17. Embryonala ögon uppträder från blastodiscs yttre epiderm och är differentierbara efter steg 18, med retinalpigmentering som börjar vid steg 20. Linsen visas som en transparent stickliknande struktur synlig för det blotta ögat i steg 25. Vi utförde först Q-PCR med primers riktade mot exon 2, som täcker alla fem varianterna. Q-PCR-analysen visade att IpPax-6 uttrycktes i steg 16 före ögonblåsbildning (figur 2a). Uttrycksintensiteten för IpPax-6 uppreglerades gradvis med utvecklingen av bläckfiskembryot (figur 2a), med ögongloben som visar de högsta uttrycksintensiteterna bland de testade vävnaderna. Som observerats hos de andra bilaterala djuren uttrycktes de autentiska och varianta formerna av ippax-6 på markant deprimerade nivåer i muskelvävnaden. Vi använde sedan primers riktade mot varianter som saknade exon 4 (varianter 1 och 3, Figur 2B). Primrarna upptäckte varianterna 1 och 3 vid låga nivåer i embryona i steg 16 och i ögonglobvävnaden. Vi använde också primers riktade varianter inklusive exon 6 (varianter 2 och 3, Figur 2C). Q-PCR-analysen visade att varianterna 2 och 3 uttrycktes i ögonbollarna och optiska lober såväl som i embryon i steg 16 och 25. Eftersom bildandet av fotoreceptorceller och linsen börjar i embryon i steg 25 kan varianterna inklusive exon 6 bidra till ögonutveckling. Resultaten visar att uttrycksmönstren för ippax-6-varianterna skilde sig avsevärt från den för autentisk ippax-6.

för att skilja vilka varianter som finns i varje steg utförde vi RT-PCR med användning av primeruppsättningar över exongränser. Variant 1 ansågs uttryckas i alla / vissa embryonala stadier men inte i de vuxna ögonen (kompletterande figur 2). RT-PCR-analys visade också att variant 4 uttrycktes starkt i de vuxna ögonen, särskilt i näthinnan, men inte i linserna (kompletterande figur 2a). Varianterna 2 och 3 uttrycktes i alla embryonala stadier och även i vuxna vävnader (kompletterande Figur 2B).

för att identifiera det vävnadsspecifika uttrycket av ippax-6-varianter utförde vi in situ hybridisering med hjälp av RNA–prober utformade för att binda specifikt till varje variant (figur 2D-G). RNA-sonden designad från exon 2 riktar sig mot alla fem varianter som identifierats i denna studie. RNA-sonden designad från exon 4 bunden till den autentiska formen och till varianterna 2 och 4. IpPax-6 befanns vara lokaliserad i hjärnområdet, inklusive dorsal basal lob, överlägsen frontal lob, peduncle/olfactory lobes och optiska lober (figur 2D–G), som beskrivs i Hartmann et al.18 vävnaden utanför näthinnan (kanske motsvarar det framtida iridoforskiktet) uttryckte också tydligt IpPax-6 i steg 22 (figurerna 2D och 2D’). Ippax-6-uttryck observerades i detta skikt fram till steg 25. In situ-hybridiseringen med sondens inriktning exon 4 föreslog att varianterna 2 och 4 hade liknande uttrycksmönster i hjärnan men inte i ögonen (figur 2e). Detta resultat tyder på att varianterna 1 och 3 (saknar exon 4) är uppreglerade i ögonens yttre lager. Dessa konsekvenser innebär att varje ippax-6-variant regleras oberoende över processerna för ögonbildning.

Exon-intron struktur av Pax – 6 i andra bläckfiskar/blötdjur

vi undersökte om denna typ av alternativ skarvning förvärvades endast i coleoid bläckfiskar. Genom att tillämpa RT-PCR-analys på japansk spjutbläckfisk (Loligo bleekeri) embryonala rna hittade vi tre typer av mRNA som eventuellt härrör från alternativ skarvning (exon 4 hoppa över, exon 3 insättning och exon 6 insättning) i ögonen (figur 3A, B). De införda exonerna 3 och 6 kodade 20 respektive 40 aminosyror, medan de hoppade över exon 4 kodade 51 aminosyror. För att undersöka förekomsten av liknande alternativ skarvning i andra blötdjursgenom undersökte vi exon-intron-strukturerna av Pax-6 i Uggla limpet och pearl oyster. Den fullständiga genomsekvensen för owl limpet (Lottia gigantea, erhållen från JGI genome portal Lotgi v1.0, e_gw1.86.103.1)19 och av pearl oyster (Pinctada fucata, erhållen från OIST Marine genomics Unit genome browser P. fucata_ver1.0, transkript: pfu_ug1.0_8418.1_67856.T1, byggnadsställning8418.1) 20 visade att molluscan Pax-6 har fem exoner. Exon 4 i bläckfisken konserverades över de testade blötdjursarterna. Exoner 3 och 5 hittades emellertid inte i pearl oyster Pax-6-genen. Således fann vi att variantformerna 2 och 4 har förvärvats i coleoid cephalopodlinjen (Figur 1).

så vitt vi vet är vår studie den första som rapporterar in-frame splicing varianter av bläckfisk Pax-6 som uttrycktes annorlunda beroende på embryonstadiet. Tidigare studier isolerade diskreta typer av skarvningsvarianter som hade förlorat den N-terminala halvan av PD-domänen i andra bläckfiskarter15,18, men dessa varianter visade inte spatio-temporala skillnader i uttryck. Vår studie föreslog också att mekanismerna bakom förvärvet av variationer i Pax-6-transkript genom alternativ skarvning har förvärvats unikt i coleoid-bläckfisklinjen, eftersom de nedre blötdjurna, såsom musslor, inte har ett motsvarande exonliknande fragment i deras genom.

funktion av squid Pax – 6-varianter och deras förmodade roll i ögonutveckling

tillsatsen och borttagningen av ett aminosyrafragment kodat i de alternativt använda exonerna förväntas orsaka strukturella förändringar i ippax-6-proteinvarianterna, vilket kan förändra deras funktion i utvecklingsprocessen. Två av dess varianter (varianter 1 och 3) saknar en 153mer i mitten av autentiska Pax-6 och hälften av HD (Figur 1). För att undersöka om raderingen påverkar deras funktionella egenskaper utförde vi tredimensionella (3D) strukturella förutsägelser av proteinerna baserat på jämförande modellering. De förmodade 3D-strukturerna för HD: erna för autentisk ippax – 6 och varianten som saknade segmentet kodat av exon 3 konstruerades. Mallstrukturen identifierades med DNA-bunden form så att vi kunde förutsäga strukturen för ippax-6 och varianten i DNA-bunden form. Den förmodade 3D-strukturen i den autentiska formen var ganska väl modellerad; kärnresterna, nämligen Phe på slingan före den första spiralen i HD, Leu på den första spiralen, Leu på den andra spiralen och Trp och Phe på den tredje spiralen i modellstrukturen, bevarades och de tre spiralerna i HD var uppenbarligen tätt packade i varandra (figur 3C). De rester som är viktiga för DNA-bindning, nämligen två Arg-rester vid N-terminalarmen och polära rester på ytan av den tredje spiralen, var belägna rimligt nära DNA-gränssnittet (figur 3C, D). Den förmodade 3D-strukturen i varianten presenterade emellertid ett antal problematiska problem. I den modellerade strukturen kompenserades förlusten av regionen kodad av exon 3, som kodar för den N-terminala delen av den första spiralen, av 15 rester kodade i exon 2. Således skilde sig aminosyrasekvenserna av de autentiska och variantformerna endast i regionen innehållande de 15 resterna av den N-terminala sidan. Denna skillnad ökade emellertid signifikant den strukturella energin hos varianten och uppenbarligen destabiliserade den övergripande strukturen. Denna instabilitet kan bero på brist på Phe på slingan före den första spiralen och av Leu på den första spiralen. Dessa komponenter är uppenbarligen viktiga för att packa de tre spiralerna. Dessutom saknades två Arg-rester vid N-terminalslingan som binder till DNA-baserna i det mindre spåret i den autentiska formen i varianten. Dessa problem i stabilitet och DNA-bindning i varianten tyder starkt på att variantens HD är instabil och att domänen har liten bindningsaffinitet för DNA (figurerna 3D och 3D’). Bristen på en stabil HD antyder vidare att varianterna 1 och 3 har olika DNA-målplatser än den för autentisk IPPAX-6 i bläckfiskarter.

två varianter (varianter 2 och 3) uppvisade också en 120 mer-insättning inom PST-domänen (Figur 1). Den infogade sekvensen befanns vara specifik för bläckfisk (Figur 2). Denna infogning kan ändra transaktionsaktiveringsaktiviteterna för PST-domänen. Variant 4 visade en unik insättning (57 meren) mellan PD och HD. Motif-programmet (http://www.genome.jp/tools/motif/) hittade inga kända domäner eller signaturer i den infogade sekvensen. Denna insättning förlänger en länk mellan PD-och HD-domänerna.