två av de mest spännande och mångsidiga genetiska verktygen som designats under de senaste 30 åren är Cre-lox-och FLP-FRT-teknologierna. Båda tillåter att platsen och tidpunkten för genuttryck regleras noggrant. Denna artikel beskriver kortfattat hur de två systemen fungerar och kan användas i musmodeller.
Cre-lox-systemet
Cre-lox-tekniken introducerades på 1980-talet (Sauer och Henderson 1988; Sternberg och Hamilton 1981) och patenterades av DuPont Pharmaceuticals. Det har framgångsrikt använts i jäst, växter, däggdjurscellkulturer och möss (Araki et al. 1987). Det är baserat på förmågan hos P1-bakteriofagcykliseringsrekombinationen (Cre) rekombinasgenen (cre) att åstadkomma rekombination mellan par av loxP-platser. Sådan rekombination i en” Cre-lox ” – mus (se nedan) kan antingen aktivera eller inaktivera en gen av intresse.
för att använda Cre-lox-teknik måste en utredare producera en Cre-lox-mus, vanligtvis genom att odla en Cre-mus till en loxP-mus. En Cre-mus innehåller en Cre-rekombinas-transgen under ledning av en vävnadsspecifik promotor; en loxP-mus innehåller två loxP-platser som flankerar ett genomiskt segment av intresse, ”floxed” locus. Vanligtvis produceras Cre-och loxP-möss med hjälp av transgen teknik (Nagy 2000). Beroende på promotorerna och andra regulatoriska kontroller som används för att konstruera dem kan Cre-möss endast utformas för att uttrycka Cre-rekombinas under vissa förhållanden, inklusive följande: i vissa vävnader, när en muss diet kompletteras med ämnen som doxycyklin, tetracyklin, RU486 och tamoxifen (Brocard et al. 1998; Kellendonk et al. 1999; Utomo et al. 1999) och under vissa utvecklingsstadier.
beroende på platsen och orienteringen av loxP-platserna i en Cre-lox-mus kan Cre-rekombinas initiera raderingar, inversioner och translokationer av floxed locus (Nagy 2000) (Fig. 1).
Fig. 1.
Cre-lox-reaktioner påverkas av orienteringen och placeringen av loxP-platser. Parade loxP-platser (trianglar) har riktning och kan placeras i en cis (samma DNA-sträng) eller trans (olika DNA-strängar) arrangemang. (A) om loxP-platserna flankerar ett DNA-segment (rektangel) i ett cis-arrangemang och är orienterade i samma riktning, förmedlar Cre-rekombinas excision eller cirkularisering av segmentet. B) om loxP-platserna flankerar DNA-segmentet i ett cis-arrangemang och är orienterade i motsatta riktningar, förmedlar Cre-rekombinas inversionen av segmentet. C) om loxP-ställena är belägna på olika DNA-strängar och är orienterade i samma riktning, förmedlar Cre-rekombinas en translokation av segmentet.
vanligtvis utvecklas Cre-och loxP-stammar oberoende och korsas sedan. Många olika Cre-stammar, som var och en innehåller en Cre-transgen under ledning av en annan vävnadsspecifik promotor, kan korsas med en enda loxP-stam. Beroende på vilka stammar som paras kan en mängd olika Cre-medierade modellsystem konstrueras, inklusive transgenik, knockouts, hypomorfer, reparerbara hypomorfer, kromosomavvikelser och dietinducerade mutanter. I själva verket, genom att blanda och matcha Cre-och loxP-stammar, kan en utredare studera en gens effekter på vävnadsspecifika och utvecklingsstadiespecifika sätt som tidigare var omöjliga.
FLP-FRT-systemet
FLP-FRT-systemet liknar Cre-lox-systemet och används oftare i musbaserad forskning. Det handlar om att använda flippase (FLP) rekombinas, härledd från jäst Saccharomyces cerevisiae (Sadowski 1995). FLP känner igen ett par FLP-rekombinasmål (FRT) sekvenser som flankerar en genomisk region av intresse.
Araki K, Imaizumi T, Okuyama K, Oike Y, Yamamura K. 1997. Effektivitet av rekombination med Cre övergående uttryck i embryonala stamceller: jämförelse av olika promotorer. J Biochem (Tokyo) 122: 977-82.
Brocard J, Feil R, Chambon P, Metzger D. 1998 ett chimärt Cre-rekombinas inducerbart av syntetiskt, men inte av naturliga ligander av glukokortikoidreceptorn. Nukleinsyror Res 26: 4086-90.
Jax anteckningar. 1999. NIH, Jackson Laboratory och Dupont Pharmaceuticals tecknar avtal om användning av Cre-lox-teknik. JAX ANTECKNINGAR 476: 4.
Kellendonk C, Tronche F, Reichardt HM, Schutz G. 1999. Mutagenes av glukokortikoidreceptorn hos möss. J Steroid Biochem Mol Biol 69: 253-9.
Nagy A. 2000. Cre rekombinas: den universella reagens för genom skräddarsy. Genesis 26: 99-109.
Sadowski P. 1995. Flp-rekombinaset av 2-sackarim-plasmiden av Saccharomyces cerevisiae. Prog Nukleinsyra Res Mol Biol 51:53-91.
Sauer B, Henderson N. 1988. Platsspecifik DNA-rekombination i däggdjursceller genom Cre-rekombinas av bakteriofag P1. Proc Natl Acad Sci USA 85:5166-70.
Sternberg N, Hamilton D. 1981. Bakteriofag P1 platsspecifik rekombination. I. rekombination mellan loxP-platser. J Mol Biol 150: 467-86.
Utomo AR, Nikitin AY, Lee WH. 1999. Temporal, rumslig och celltypspecifik kontroll av Cre-medierad DNA-rekombination i transgena möss. Nat Biotechnol 17: 1091-6.