HPV/P16 positiva och negativa HNSCC visar skillnader i nodal involvering
vi bestämde HPV-och p16-statusen för 241 orofaryngeal skivepitelcancer (OPC) patienter behandlade med (kemo)strålning (C)RT. De mänskliga tumörproverna förvärvades enligt protokoll som godkänts av etiska styrelsen för universitetssjukhusen Leuven (Leuven, Belgien) och underförstått samtycke från alla patienter erhölls. Kliniska patologiska data extraherades från patientdiagram och den genomsnittliga uppföljningstiden var 4,19 år. HPV-positiva patienter kännetecknades av lägre t-steg med 45% (26 av 58; p = 0, 025) av HPV-positiva patienter som visade T1/2-stegs tumörer medan detta var 29% (51 av 175; p = 0, 025) i HPV-negativa gruppen. Dessutom visade HPV-positiva tumörer signifikant högre (p = 0.014) nodal involvering med 72% (42 av 58) av HPV-positiva patienter som visade N2/N3-tumörer medan detta endast var 54% (95 av 175) i HPV-negativa gruppen. Även om förhållandet mellan P16-status och N-scenen inte var signifikant sågs en trend till högre nodal involvering och P16-positivitet. Sextiotre% av P16-positiva patienter visade N2 / N3-tumörer, medan detta endast var 54% i den P16-negativa gruppen (Tabell 1). Dessa resultat överensstämmer med andra studier, vilket visar att HPV-positiva HNSCC-patienter har högre n-och lägre t-steg .
som förväntat resulterade låga T-steg i bättre fjärrkontrollhastigheter (DC) med 5-års kontrollhastigheter på 83% och 70% (p = 0, 04) för T1/T2 respektive T3 / 4 tumörer (ytterligare fil 1: figur S1A). N2 / 3-tumörer (5-årig DC 70%; p = 0,02) visade en högre risk för avlägset misslyckande jämfört med N0/1-tumörer (5-årig DC-hastighet 85%; p = 0,02) (ytterligare fil 1: figur S1B). Ingen statistiskt signifikant skillnad sågs i DC-hastighet mellan HPV-positiv och negativ sjukdom (5-årig DC-hastighet på 82% respektive 5-årig DC-hastighet på 72%; p = 0,20) (tilläggsfil 1: figur S1C). Även om det inte är signifikant, föreslår denna 10% skillnad i DC-hastigheter påverkan av viruset bortom lokal tumörkontroll. Dessutom indikerar det förekomsten av olika spridningsmönster mellan HPV-positiva och negativa HNSCC.
p16 undertrycker invasionen och migrationskapaciteten hos HPV-positiva HNSCC
för att undersöka den molekylära mekanismen bakom dessa potentiella skillnader som ses i metastaser i vår patientkohort, bedömde vi in vitro migration och invasionskapacitet hos HNSCC-celler. HPV / p16-positiva SCC154-och SCC104-celler visade en signifikant lägre migrationshastighet jämfört med HPV/p16-negativa sqd9 -, CAL27-och SC263-celler (Fig. 1a). I överensstämmelse med migrationsanalysen visade HPV/p16-positiva celler minskad invasionsförmåga jämfört med HPV/p16-negativa celler (Fig. 1b).
p16 represses the in vitro invasion and migration capacity of HPV positive HNSCC. a Migration capacity of HPV negative cells (SQD9, CAL27 and SC263) and HPV positive cells (SCC154, SCC104). b Invasion capacity of HPV negative SQD9 cells and HPV positive SCC154 cells. c Migration capacity of HPV positive SCC154 cells treated with shRNA for p16 (shp16) and control (shluc). D Invasionskapacitet för HPV-positiva SCC154-celler behandlade med shRNA för p16 (shp16) och kontroll (shluc). (a-d) resultatet visas som medelvärde av tre experiment och p-värden beräknas med tvåsidigt t-test
tumörsuppressorn p16 är en välkänd cellcykelregulator och en bra surrogatmarkör för HPV-positiv HNSCC . Dessutom tillskriver nya data en bredare roll för p16, inklusive en roll i migration och förtryck av angiogenes . Därför undersökte vi också påverkan av p16 på migrations-och invasionskapaciteten hos HPV-positiva SCC154-celler manipulerade med kort hårnål RNA (shRNA) för p16 (shp16) och kontroll shRNA (shluc). Nedreglering av P16-uttryck ökade migrations-och invasionskapaciteten hos SCC154-cellerna (Fig. 1c och d). Dessa data verifierar förekomsten av skillnader i spridningsmönster mellan HPV-positiv och negativ HNSCC och föreslår en aktiv roll av p16 i den metastatiska kaskaden.
p16 undertrycker migration och invasion genom angiogenes i HPV-positiv HNSCC
det är välkänt att angiogenes, som aktivt upprätthålls i cancerceller av pro-angiogena faktorer såsom vaskulär endoteltillväxtfaktor A (VEGFA), är en ledning för cancercellspridning och metastasering och främjar aggressiv Tumörprogression . Dessutom beskrivs den negativa korrelationen mellan HPV/p16 och VEGFA tidigare i HNSCC . Därför bedömde vi förhållandet mellan HPV, p16 och VEGFA i vår patientkohort. HPV-positiva patienter visade signifikant lägre VEGFA-uttryck med 54% (28 av 51) av patienterna som visade inget eller lågt VEGFA-uttryck jämfört med 32% (53 av 161) i HPV-negativ grupp (Tabell 2). Även om den negativa korrelationen mellan VEGFA och p16 var mindre uttalad sågs en trend till Betydelse (Tabell 2).
vi undersökte vidare förhållandet mellan angiogenes och p16 med in vivo xenografter injicerade med SCC154 HPV-positiva celler manipulerade med shp16 eller shluc. Ett högre antal blodkärl detekterades i mösstumörer med lågt P16-uttryck jämfört med kontrolltumörer (Fig. 2a). Vidare resulterade ökningen av vaskularisering i lägre nekros, högre antal mitotiska celler och tillväxtfördel med shp16-Uttryckande tumörer (ytterligare Fil 2: Figur S2A-C). Vi kunde inte verifiera involveringen av p16 i undertryckande av metastaser in vivo på grund av frånvaron av en metastatisk djurmodell. Tillväxtfördelen och den ökade vaskulariseringen som ses i shp16-mösstumörer kan dock förklara den frekventa förekomsten av avancerade T-steg hos HPV-negativa HNSCC-patienter.
dubbel roll av p16 vid spridning av HNSCC. en blodkärlsbildning i SCC154 shp16 – och SCC154 shluc xenograft-musmodeller bedömda genom CD31-färgning (ovanför grafen); n = 5. B Genomsnittligt antal lymfkärlbildning i SCC154 shp16 och SCC154 shluc xenograft-musmodeller bedömda genom LYVE – 1-färgning (ovanför grafen); n = 5. C genomsnittlig poäng för alfa4 beta1 integrinfärgning i SCC154 shp16-och SCC154 shluc – musens xenograftmodeller; n = 5. d Average score of alpha4 beta1 integrin staining in HPV positive SCC154 (n = 7) and HPV negative SQD9 (n = 10) mouse xenograft models. a-d P-värden beräknas med tvåsidigt t-test
p16 stimulerar lymfangiogenes och nodal spridning i HPV-positiva HNSCC
dessa resultat förklarar fortfarande inte förekomsten av liknande avlägsna återfallshastigheter hos HPV/p16 positiva och negativa HNSCC-patienter och förklarar verkligen inte den mycket signifikanta sambandet mellan HPV-patienter och positivitet och nodal engagemang som beskrivs i våra och flera andra studier . Detta är särskilt viktigt eftersom det implicerar närvaron av en hög lokal metastatisk potential i HPV-positiv HNSCC. Intressant lymfangiogenes, som angiogenes, främjar tumörmetastas genom att inducera tillväxten av nya lymfkärl i tumören och genom att förbättra cellhandel till lymfkörtlar. Dessutom är ökad lymfatisk kärltäthet i tumörer associerad med ökad metastas till lymfkörtlar. . Därför bedömde vi lymfkärlbildningen genom homolog lymfkärl hyaluronan (LYVE-1) immunfärgning i shluc-och shp16-mösstumörer. Vi fann att P16-undertryckning resulterade i lägre lymfkärltäthet i HPV/p16-positiva xenografter som tyder på en dubbel roll av p16 i metastas (Fig. 2b).
för att förstå funktionen av p16 fokuserade vi på integriner eftersom dessa proteiner accepteras som nyckelregulatorer för angiogenes och lymfangiogenes . Dessutom har bindningen av p16 till integriner och förlust av cellspridning tidigare dokumenterats . Integriner såsom alfa4 beta1 är viktiga modulatorer för lymfangiogenes . Därför bedömde vi närvaron av alfa4 beta1 integrin i SCC154 shluc och SCC154 shp16-mösstumörer. Although not statistically significant (p = 0.09), shluc tumors showed a higher percentage of integrin compared to shp16 tumors (Fig. 2c). In line with SCC154 shRNA xenografts, tumors from HPV/p16 positive SCC154 xenografts showed higher percentage of alpha4 beta 1 integrin compared to tumors from HPV/p16 negative SQD9 xenografts (Fig. 2d).