bakteriofager, även kallade fager, är virus som specifikt infekterar bakterier och vi kan bekräfta deras närvaro och kvantifiera dem med hjälp av ett verktyg som kallas plackanalysen. Bakteriofager infekterar sina mottagliga värdar genom att först fästa vid bakteriecellväggen och injicera deras genetiska material. Sedan kapar de cellens biosyntetiska maskiner för att replikera deras DNA och producera många avkomma fagpartiklar, som de sedan släpper ut genom att lysera och döda värdcellen.
denna lytiska aktivitet är grunden för en allmänt använd fagräkningsteknik som kallas plackanalys eller dubbel agarlageranalys. Här framställs en bakteriofagblandning först i en smält näringsbuljong innehållande agar med låg koncentration. Alla bakterier som används i blandningen bör vara levande och aktivt dela i loggfasen av deras tillväxt, vilket säkerställer att en stor andel av bakterierna är livskraftiga och kan bilda en tät gräsmatta runt plackarna. Därefter sprids denna smälta bakterie-fagagarblandning över ett mer fast, koncentrerat agarnäringsmedium som redan stelnat på en petriskål. Vid inkubation vid rumstemperatur stelnar den låga koncentrationen agar-FAG-bakteriebuljong också för att bilda en mjuk agaröverlagring.
Här kan bakteriecellerna härleda ytterligare näringsämnen från bottenskiktet och bör snabbt föröka sig för att producera en sammanflytande gräsmatta av bakterier. Eftersom fagpartiklar också finns i det mjuka skiktet kommer dessa att infektera och replikera sitt genetiska material i bakterierna, vilket kulminerar i celllys, vilket frigör flera avkommor. Dessa fagavkomman infekterar sedan de närliggande cellerna, eftersom det halvfasta tillståndet hos bakteriefagskiktet begränsar deras rörelse till mer avlägset belägna värdceller. Denna cykel av infektion och LYS fortsätter över flera omgångar och dödar ett stort antal bakterier i ett lokaliserat område. Effekten av att de närliggande cellerna förstörs är att producera en enda cirkulär klar zon, kallad en plack, som kan ses med blotta ögat, vilket effektivt förstärker bakteriens lytiska aktivitet hos Fagen och möjliggör deras uppräkning.
antalet plack på en petriskål kallas plackbildande enheter, eller PFU, och, förutsatt att den initiala bakteriofagkoncentrationen var tillräckligt utspädd, bör direkt motsvara antalet infektiva fagpartiklar i det ursprungliga provet. Denna teknik kan också användas för karakterisering av plackmorfologi, för att hjälpa till vid identifiering av fagtyper eller för att isolera fagmutanter. I det här labbet lär du dig att utföra plackanalysen för att räkna upp fager, med T7-Fagen av E. coli som ett exempel.
identifiera först ett lämpligt medium för odling av värdbakteriecellerna och bakteriofagen. Här användes lysogeni-buljong, eller LB-medium, för att odla E. coli och T7-Fagen. Ta sedan tre rena glasflaskor och märk dem med media, namn och sedan den första som lb-buljong, den andra som LB-Bottom Agar och den tredje som LB-Top Agar. Väg nu ut fyra gram förformulerat LB-pulver i tre uppsättningar och överför sedan en uppsättning vägda torkade medier i varje flaska. Tillsätt 200 ml vatten till den första flaskan. Blanda innehållet med en magnetisk omrörningsstång.
använd sedan en pH-mätare och konstant omrörning, bringa det slutliga pH-värdet till 7, 4 genom tillsats av natriumhydroxid eller saltsyra. Upprepa vattentillsatsen och pH-justeringen för de andra två återstående flaskorna också. Väg nu ut tre gram agarpulver och lägg det till den andra flaskan för att göra en 1,5% bottenagar. Slutligen väger 1. 2 gram agar och lägga till den tredje flaskan för att göra .6% LB topp agar. Buljongtillståndet i flaska man behöver inte en agar tillsats. Täck flaskan halvt tätt och sterilisera sedan mediet genom autoklavering vid 121 grader Celsius i 20 minuter. När du är klar tar du bort medieflaskorna från autoklaven och vrider omedelbart flaskhattarna för att stänga dem helt för att förhindra kontaminering. Förvara lb-buljong och LB-Top Agar media på bänken för senare användning. Placera lb-Bottenagaren för att svalna i ett vattenbad som är förinställt till cirka 45 grader Celsius.
När lb-bottenagaren når cirka 45 grader Celsius, överför den till arbetsbänken. Sterilisera sedan arbetsytan med 70% etenol. Därefter tillsätt 450 mikroliter steril en molär kalciumklorid till den smälta bottenagaren för att göra en slutlig koncentration av 2.25 millimolar. Vrid försiktigt flaskan för att blanda. Ställ sedan ut sju rena petriskålar. Märk varje maträtt på botten med medianamn och beredningsdatum. Häll sedan 15 ml av bottenagaren i var och en av de sju Petriskålarna. Låt plattorna ställa in i några timmar eller över natten vid rumstemperatur. När de är inställda kan odlingsplattorna förvaras vid fyra grader Celsius i flera dagar om det behövs, upp och ner för att minimera kondens. Överför Petriskålarna från fyra grader Celsius-kylskåpet till en 37 grader Celsius-inkubator en timme före analysen.
dagen innan analysen ska förformas bör E. coli odlas. Här inokulerades 10 mikroliter E. coli-kultur i 10 ml LB-buljong. Placera bakterierna för att växa över natten i en skakande inkubator inställd på 37 grader Celsius vid 160 RPM. Sedan, på analysdagen, ta bort bakteriekulturen från inkubatorn. Frö en färsk 10 ml färsk LB-buljong med 0,5 ml av nattkulturen. Placera dessa celler för att växa till en skakande inkubator inställd på 37 grader Celsius vid 160 RPM. Använd sedan en spektrofotometer för att kontrollera när denna kultur når loggfastillväxt, indikerad med en optisk densitet på 0, 5 till 0, 7. När OD når denna nivå, stoppa inkubationen genom att överföra cellkulturen till bänken. De är nu redo att användas för fagöverlagringsanalys.
Fagtitrar kan variera exponentiellt mellan olika fagtyper och prover. Så för att räkna dem effektivt bör de spädas för att generera ett brett spektrum av fagkoncentrationer. På dagen för analysen, generera en serie fagutspädningar som sträcker sig från en tiondel till en miljonte koncentration, efter en 10-faldig utspädningsteknik. För att få statistiskt signifikanta och exakta data, utför seriell utspädning i tre exemplar.
smält sedan den stelnade lb-toppagaren med en mikrovågsugn. Placera det sedan i ett vattenbad som är förinställt vid 45 grader Celsius i en timme. Efter en timme samlar du Petriskålarna som innehåller bottenagarskiktet från inkubatorn. Märk plattorna med fagkoncentration och analysdatum. Ställ sedan ut sju rena provrör. Märk varje provrör med det seriella fagutspädningsnumret och ange ett som kontroll.
När lb-top-agar når 45 grader Celsius, överför den till arbetsbänken. Lägg nu till 450 mikroliter av en molär kalciumklorid till 200 ml agar för att göra en slutlig koncentration av 2,25 millimolar. Vrid försiktigt flaskan för att blanda. Tillsätt sedan 35 ml LB-top-agar och fyra ml bakteriell suspension till ett sterilt koniskt rör. Snurra försiktigt för att jämnt fördela cellerna men undvik att skaka för att förhindra skumning.
nu, alikvot fem milliliter av denna bakterie – topp agarblandning till var och en av de sju provrören. Överför sedan 100 mikroliter av de seriellt utspädda bakteriofagproverna och kontrollmedierna, som helt enkelt ska vara media utan bakteriofag, till de respektfullt märkta provrören. Vrid blandningen försiktigt för att säkerställa korrekt blandning. Överför försiktigt fem milliliter bakteriofagblandning på respektive Petri-platta. Sprid blandningen jämnt över hela ytan genom att försiktigt virvla runt Petri-plattan.
När alla Petri-plattorna är skiktade med blandningen, låt stelna det övre lagret genom att inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter. Efter slutförandet av dessa steg, upprepa processen för den andra och sedan den tredje uppsättningen av Petriskålarna med de återstående två uppsättningarna av fagutspädningar. Försegla varje maträtt med parafilm och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter. Placera odlingsplattan upp och ner vid en lämplig temperatur i 24 timmar eller tills plack utvecklas. Här placerades plattor i en inkubator på 37 grader Celsius under en dag, ett stimulerande tillväxttillstånd för E. coli och T7-Fagen.
plack kommer att visas efter en till fem dagars inkubation, beroende på bakteriearter, inkubationsförhållanden och valet av medium. Här var plack synliga efter en dag av inkubation vid 37 grader Celsius. Börja med att kontrollera plattorna märkta kontroll och se till att inga plack bildades i dessa plattor, eftersom detta skulle indikera viral kontaminering. För att bestämma fagtitern i det ursprungliga provet, börja med plattorna som innehåller det mest utspädda fagprovet först och räkna plåtarna utan att ta bort locken och markera dem för att ange vilka som redan har räknats. Upprepa räkningen för varje platta i varje uppsättning. Vissa plattor kan ha för många eller för få plack att räknas. Betrakta 10 till 150 som ett idealiskt plackantal.
nästa, generera en tabell som visar placknummervärdena för de olika utspädningarna och replikaten. Beräkna sedan de genomsnittliga placktalvärdena för utspädningsplattorna som innehöll det ideala antalet plackantal. I detta exempel var dessa det genomsnittliga antalet plack bildade i 10 till minus tre och 10 till minus fyra utspädningsplattor. Justera nu för fagutspädningsfaktorn genom att dividera de erhållna genomsnittliga plackvärdena med respektive fagutspädningsfaktorer. Här delades det genomsnittliga antalet plack som bildades till 10 till minus tre och 10 till minus fyra utspädningsplattor med deras respektive utspädningsfaktorer för att erhålla antalet plackbildande enheter, eller PFU, i 100 mikroliter fagblandning. För att konvertera värdet till PFU per milliliter, multiplicera de genererade värdena med 10, eftersom endast 100 mikroliter fagutspädningsblandning användes under beredningssteget för bakteriofagöverlagring, vilket gav en ytterligare utspädningsfaktor på 10. Slutligen beräkna medelvärdet av de värden som erhållits från de olika utspädningsplattorna. Detta ger det genomsnittliga antalet PFU per milliliter. Antalet PFU motsvarar antalet infektiva fagpartiklar i det ursprungliga provet.