androgenreceptorn (AR) är medlem i steroidhormonet kärnreceptor superfamilj som inkluderar östrogen, progestin, glukokortikoid och mineralokortikoidreceptorer.1 bindningen av den prototypiska, endogent producerade androgentestosteron (1) och den viktiga aktiva metaboliten dihydrotestosteron (2) till AR initierar ett anmärkningsvärt varierat utbud av biologiska aktiviteter som kan variera beroende på ämnets kön, ålder och hormonell status. Ar-aktiviteten är avgörande för normal mänsklig sexuell utveckling och funktion, men utöver denna signaturroll har ar-aktivering också viktiga effekter på olika mål som ben, lever, muskler och centrala nervsystemet.2,3 den terapeutiska potentialen för androgensignalering uppskattas väl i läkemedelskemisamhället, och under ganska lång tid har kemister sökt föreningar som selektivt stimulerar muskel-och bentillväxt samtidigt som de minimerar de proliferativa och/eller hypertrofiska effekterna på könsvävnader som prostata hos män och klitoris hos kvinnor.4,5 sådana föreningar har kallats selektiva androgenreceptormodulatorer eller SARMs. I detta avseende anses den prototypiska och endogena androgenen, testosteron, vara en logisk riktmärkeskomparator. Förening 3 är GTx SARM S-22 och förening 4 är BMS SARM 562929, som båda har rapporterats i litteraturen som oralt aktiva föreningar med selektivitet för muskel över prostata i förhållande till testosteron i olika prekliniska modeller.6,7

möjligheten att erhålla föreningar med vävnadsselektiva aktiviteter som skiljer sig från det endogena riktmärket testosteron kan härledas från det faktum att typisk ar-receptoraktivering, som initieras genom bindning av en molekyl med affinitet för AR till AR-ligandbindningsdomänen, följs sedan av en ganska anmärkningsvärd, samordnad serie interaktioner: Dessa kan inkludera en förändring i receptortopologi, dissociation av värmechockproteiner, receptordimerisering, receptorfosforylering, snabbsignaleringshändelser, translokation till kärnan (AR), förening med många olika koreregulatoriska proteiner för att bilda ett transkriptionskomplex som resulterar i aktivering eller undertryckande av RNA-syntes från AR-modulerade gener och slutligen receptornedbrytning.8 eftersom varje receptor−ligandkomplex topologi är unik för den ligandstrukturen, kan man uppskatta att interaktionen mellan ett visst ligandreceptorkomplex och koreregulatoriska proteiner sannolikt också är unik för den liganden. Dessutom, eftersom uttrycksnivån för AR, konstellationen och uttrycksnivån för koreregulatoriska proteiner och mönstren för posttranskriptionella regulatoriska händelser skiljer sig åt i varje typ av androgenmålcell, och topografin för AR-regleringsställen i genomet skiljer sig åt vid varje gen, ger denna anmärkningsvärda koreografi av händelser och interaktioner en rik miljö inom vilken man kan söka efter SARMs som har ett önskvärt mönster av vävnadsselektiv farmakologi, såsom hög anabolisk men begränsad androgenaktivitet.

ytterligare komplicerar vår förståelse av ursprunget till SARM selektivitet är ”bio-amplifiering” av den primära endogena androgen testosteron. Intressant är att det endogent producerade och mycket viktiga androgentestosteron tjänar som en typ av ”anti-SARM” eller ”invers SARM” eftersom dess androgena aktivitet ökas genom omvandling till det mer potenta 5 kg-dihydrotestosteron av 5 kg-reduktasenzymet i vissa vävnader inklusive hårbotten och prostata (men inte i muskel eller ben). Som ett resultat kommer androgener som inte genomgår sådan bioamplifiering i prostata att visa förbättrad selektivitet avseende muskel vs prostata jämfört med en testosteronbehandlad kontroll eller ett intakt djur vars primära endogena androgen är testosteron.9 mer allmänt uttryckt kan man uppskatta att metaboliska skillnader mellan endogena androgener som testosteron eller dihydrotestosteron och SARMs också kan garantera åtminstone vissa selektivitetsskillnader.

vårt arbete inom SARM-området resulterade i syntes och utvärdering av ett stort antal kandidatmallar. Medan vi fann det relativt lätt att erhålla föreningar med hög affinitet för AR, kämpade vi för att uppnå föreningar som visade god oral effekt och hög in vivo-tolerans. Efter att ha skannat många potentiella ledningar för oral, in vivo-aktivitet, kom vi fram till hög affinitetsförening 5 genom en kombination av syntetisk mellanliggande testning, litteraturutvärdering och fragmentkombination. Vi var glada när 5 visade oral aktivitet hos råttor.

men när vi utförde en farmakokinetisk analys på råttor kunde vi bara upptäcka mycket låga nivåer av 5 Efter oral dosering (F < 5%). Ytterligare analys avslöjade att 5 effektivt omvandlades till 6in vivo, förmodligen av cytokromer P450 i råttlever.10-förening 6 hade liknande aktivitet som förening 5in vivo, vilket tyder på att 6 till stor del var ansvarig för aktiviteten hos förening 5.11 En in vitro-skärm med humana mikrosomer avslöjade snabb metabolism av förening 5, vilket indikerar denna omvandling som ett potentiellt humant metaboliskt ansvar och fick oss att förbereda föreningar i vilka 4′-positionen för den hängande fenylen blockerades från P450-inducerad hydroxylering.12 vi tittade på flera analoger innehållande en 4 ’ – blockerande grupp, och under våra ansträngningar identifierade vi förening 7 (RAD140; figur Figure1)1) som vår prekliniska utvecklingskandidat.

syntesen av förening 7 visas i Schema 1.13, 14 vi förlitade oss på en snabb, ipso-fluor substitution av den vänstra prekursorn, Bit 8, med d-treonin i närvaro av K2CO3 i DMSO för att ge den önskade produkten 9 i fungerande utbyten (typiskt >50%). D-Thr-addukten 9 kopplades med 4-cyanobensohydrazid under standardkopplingsförhållanden med användning av EDCI och HOBt. Den resulterande produkten 10 silylerades med TBDMS-Cl, utsattes för dehydrativa cykliseringsbetingelser i närvaro av TPP/I2 och avsilerades sedan för det sista steget.15-17 Sammantaget har detta visat sig vara en pålitlig och effektiv syntes med en ganska billig, om än icke-proteinogen aminosyra som kiralitetskälla.

stabiliteten hos RAD140 var hög (t1/2 > 2 h) i inkubationer med råtta, apa och humana mikrosomer, och den hade också god biotillgänglighet hos råttor (F = 27-63%) och apor (65-75%). RAD140 visade utmärkt affinitet för androgenreceptorn (Ki = 7 nM vs 29 nM för testosteron och 10 nM för DHT) samt god selektivitet över andra steroidhormonkärnreceptorer, med den närmaste off-målreceptorn progesteronreceptorn (IC50 = 750 nM vs 0.2 nM för progesteron).18in vitro funktionell androgenagonistaktivitet bekräftades i c2c12 osteoblastdifferentieringsanalysen, där en EC50 på 0,1 nM visades (DHT = 0,05 nM).19

RAD140 karakteriserades i ett antal in vivo-analyser för att bestämma dess orala effekt på ett antal parametrar associerade med androgen aktivitet i prekliniska modeller. Till exempel doserades RAD140 i både unga kastrerade och intakta hanråttor för att bedöma dess effekter genom en rad endogena androgena signaleringsbakgrunder. Den unga kastrerade råttan ger en mycket känslig in vivo-analys för androgen aktivitet eftersom djuret är relativt androgen-na uscorive; sålunda läggs någon signalaktivitet från ett exogent administrerat androgen på en väsentligen tom bakgrund.20 i Figur Figur2, 2, effekten av ökande doser av oralt administrerad RAD140 (0.5% metylcellulosa) på levator ani bulbocavernosus muskel (”levator ani” eller ”LABC”) vikt och prostatavikt visas i förhållande till vehikel (kastrerad kontroll), skam (icke-kastrerad kontroll) och testosteronpropionat (TP) doserat subkutant vid 1 mg/kg i majsolja.21 som framgår stimulerar RAD140 levator – ani-muskeln som börjar i en dos av 0, 03 mg/kg (po) och når en effektivitetsnivå som motsvarar det skamdrivna djuret vid 0, 3 mg/kg.

eftersom vi konsekvent observerade att RAD140 misslyckades med att uppnå en nivå av prostata eller seminal vesikelstimulering lika med TP vid 1 mg/kg (oavsett hur hög dosen av RAD140), bestämde vi oss för att testa om RAD140 kunde motverka effekten av TP på råtta prostata och seminal vesiklar och samtidigt bestämma vilken effekt samtidig administrering av RAD140 och TP kan ha på levatorani-muskeln. Från resultaten som visas i Figur Figure3, 3 är det uppenbart att en hög dos av RAD140 (10 mg/kg, po) faktiskt motverkar effekten av TP vid 1 mg/kg på de partiella vesiklarna men lägger till effekten av TP på levator ani-muskeln. Vi kunde konstatera att den effektiva dosen för att uppnå antagonism med RAD140 är 0,3−1 mg/kg (po) för 1 mg/kg TP (sc) (data visas inte). I prostata orsakade RAD140 också en nedåtgående trend i stimuleringen av TP, men förändringen nådde inte statistisk signifikans. Således verkar RAD140 i den unga kastrerade manliga råttmodellen vara en potent och fullständig androgenagonist på levatorani, men en svagare, partiell antagonist på den seminala vesikeln och eventuellt prostata.22

målet för de flesta prekliniska in vivo-modeller är att bäst förutsäga hur ett läkemedel kommer att prestera i läkemedelsmålpopulationen. När man överväger frågan om hur stimulerande en androgen är på en given vävnad i en preklinisk modell, bör man komma ihåg att bakgrundsnivån för androgensignalering kan påverka svaret som observerats hos ett djur. Den kastrerade råttmodellen har begränsningar eftersom den mycket låga endogena androgennivån i denna modell är en artificiell situation, vilket inte återspeglas i den vuxna mänskliga manliga populationen.23 i synnerhet kommer den manliga målpopulationen att ha en androgen bakgrund långt över ett kastrat, även om androgennivåerna sannolikt kommer att vara lägre än normen för deras grupp.

för att bättre förstå hur denna grupp kan reagera bestämde vi oss för att titta på unga intakta hanrotter, eftersom de har endogen testosteron men på något reducerade nivåer. Därför behåller de prostata känslighet för en androgen förening men har samtidigt en baslinjestimulering som liknar målpopulationen än kastrerade djur. Såsom visas i Figur Figure4, 4, RAD140 ökade vikten av levator ani-muskeln över den för den intakta kontrollen med början med den lägsta testade dosen (0, 1 mg/kg). Intressant visade RAD140 ingen stimulering av prostata över den intakta djurkontrollnivån tills den högsta testade dosen, 30 mg/kg. Vid 0,3 mg/kg visade RAD140 muskeleffekt liknande TP vid 0,5 mg/kg, men en dos på 30 mg/kg RAD140 krävdes för att approximera prostataffekten på 0,5 mg/kg TP.24 av denna studie är det uppenbart att RAD140 hos unga intakta hanråttor har ett mycket brett spektrum av selektivitet i förhållande till både TP-behandlade råttor och skamkontrollråttor.

slutligen var vi intresserade av att utvärdera effekten av RAD140 hos unga, manliga cynomolgösa apor för att fastställa effektiva doseringsnivåer i vad vi ansåg vara en mer relevant preklinisk Art. Vi utförde en relativt enkel, icke-terminalstudie som fortfarande gjorde det möjligt för oss att utvärdera anabola såväl som lipid och andra kliniska kemiparametrar. För att bedöma anabolisk aktivitet tittade vi först på brutto kroppsvikt, som vi visste var en känslig markör för anabolisk androgenverkan hos unga icke-mänskliga primater. Resultaten på djurens kroppsvikt av 28-dagars dosering med RAD140 vid 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg och 1 mg / kg visas i Figur Figur55.

På grund av den lilla gruppstorleken (n = 3 för varje doseringsgrupp) använde vi varje djurs bakgrundsviktförändring för veckorna före experimentet för att fastställa baslinjen som kontroll. Eftersom den genomsnittliga kroppsvikten för varje grupp av tre apor konvergerade till ett nästan identiskt antal (dag -1), med det absoluta kroppsviktintervallet mellan grupper på endast 4,26−4,29 kg, ritade vi den absoluta kroppsvikten i Figur Figur5.5. I denna studie uppnåddes en genomsnittlig viktökning på mer än 10% på bara 28 dagars dosering i en dos på bara 0, 1 mg/kg, med en liknande effekt observerad vid doseringsgruppen 1, 0 mg/kg.26

dubbel energi röntgenabsorptiometri (”DEXA”) skanningar av alla apor togs två dagar innan doseringen började och en dag efter den slutliga dosen (dag -2 och Dag 29) för att bestämma effekterna av RAD140 på magert vävnad och fett; resultaten visas i Figur Figur6.6. Som framgår var det ingen konsekvent effekt på absolut fettmassa, medan muskeln visade en kvalitativ trend som ökar med dosen. Även om det verkar som att majoriteten av massökningen som visas i Figur Figure55 berodde på mager massökning, var ingen av vävnadsviktökningarna ganska statistiskt signifikanta (p > 0.05), vilket kan bero på de små gruppstorlekarna (n = 3) och relativt stora standardavvikelser.27

klinisk kemi indikerade den förväntade sänkningen av lipider (LDL, HDL, triglycerider).28 trots de ganska dramatiska ökningarna i kroppsvikt under en så kort tid var det ingen höjning av leverenzymtransaminasnivåerna hos något djur vid någon dos >2 gånger över dess basvärde.29,30 med tanke på det väletablerade förhållandet mellan oral androgenanvändning och leverstressindikatorer var vi ganska nöjda med att vi vid en dos 10 gånger större än den fullt effektiva dosen såg minimala leverenzymhöjningar.31Taken i summa, RAD140 har alla kännetecken för en SARM. Det är potensselektivt, eftersom det stimulerar muskelviktökningar vid en lägre dos än vad som krävs för att stimulera prostataviktökningar. Dessutom är det också effektivitetsselektivt, eftersom det är helt anaboliskt på muskler men visar mindre än fullständig effekt på prostata och seminala vesiklar och kan faktiskt delvis motverka stimuleringen av de partiella vesiklarna som induceras av testosteron. RAD140 har utmärkt farmakokinetik och är en potent anabol i icke-humana primater också. Vi tror att den övergripande prekliniska profilen för RAD140 är mycket bra, och föreningen har slutfört preklinisk toxikologi hos både råttor och apor. Vi förbereder för närvarande RAD140 för kliniska fas i-studier på patienter som lider av svår viktminskning på grund av cancerkakexi.