shRNA kontra siRNA

RNA-interferens (RNAi) är en biologisk process där RNA-molekyler används för att hämma genuttryck. Typiskt skapas korta RNA-molekyler som är komplementära till endogent mRNA och när de införs i celler, binder till målet mRNA. Bindning av den korta RNA-molekylen till mål-mRNA inaktiverar funktionellt mål-mRNA och leder ibland till nedbrytning av mål-mRNA.

historiskt har två typer av korta RNA-molekyler använts i RNAi-applikationer. Små interfererande RNA (siRNA) är typiskt dubbelsträngade RNA-molekyler, 20-25 nukleotider i längd. När de transfekteras till celler hämmar siRNA mål-mRNA tillfälligt tills de också bryts ned i cellen. Små hårnål rna (shRNA) är sekvenser av RNA, vanligtvis cirka 80 baspar i längd, som inkluderar en region med intern hybridisering som skapar en hårnålstruktur. shRNA-molekyler bearbetas i cellen för att bilda siRNA som i sin tur slår ner genuttryck. Fördelen med shRNA är att de kan införlivas i plasmidvektorer och integreras i genomiskt DNA för längre sikt eller stabilt uttryck, och därmed längre knockdown av målet mRNA.

effektivt uttryck av shRNAs från RNA-polymeras III-promotorer

små RNA inklusive shRNAs transkriberas endogent med RNA-polymeras III (Pol III). Detta skiljer sig från cDNA som transkriberas med hjälp av RNA-polymeras II. för att garantera högt uttryck av shRNA använder Cellecta promotorer som specifikt binder Pol III, U6-och H1-promotorerna. Både U6-och H1-promotorerna fungerar bra för att uttrycka höga nivåer av shRNAacross många celltyper, jämfört med Pol II-promotorer som CMV och EF1, som inte uttrycker shRNAs lika effektivt på grund av sin lilla storlek. Dessutom kan Pol II-promotorer som används för att uttrycka shMIRs inte fungera i de flesta celltyper, där U6 och H1 fungerar bra.

Lentivirala vektorer möjliggör Permanent Knockdown av mål

shRNA blir stabilt integrerat i värdcellgenomet. När celler delar sig överförs shRNA till dotterceller. Användning av lentivirala vektorer för uttryck av shRNAs ger permanent knockdown utan att behöva transfektera cellerna flera gånger. För att ta reda på mer om hur lentivirala vektorer fungerar, se vår lentiviral vector system sida.

optimering av shRNA Design

utforma effektiva shRNAs är viktigt för effektiv RNAi knockdown screening. Förutom att välja den optimala sekvensen finns det ett antal strukturella faktorer som påverkar shRNA-effekten. För övrigt, stam-loop hårnål struktur shRNA utgör problem för bibliotek konstruktion och förstärkning. För att skapa representativa kvalitet shRNA bibliotek, har vi fokuserat betydande ansträngningar för att optimera effektiv av shRNA skär i våra bibliotek. Vi har utvecklat en egen algoritm för att förutsäga de mest effektiva shRNA-sekvenserna, och kombinera detta med publicerade data om validerade sekvenser när vi bygger våra bibliotek. Vi har också optimerat strukturen för shRNA för bibliotekskonstruktion.

för att effektivt testa shRNA-strukturvariationer i stor skala utvecklade vi en shRNA-effektivitetstestteknik med hög genomströmning baserad på en reporteranalys. Det visades tidigare att en reportergen (såsom GFP) med en 3′ – fusion till ett cDNA-fragment eller kort oligonukleotid från en målgen kunde effektivt användas för att övervaka effekten av siRNA-och shRNA-konstruktioner mot denna målgen. Baserat på dessa resultat utvecklade vi en lentiviral reportervektor för identifiering av funktionella shRNA-konstruktioner (Figur 1). Vår egenutvecklade shRNA – testreportervektor möjliggör kloning av både shRNA-Mall nedströms H1-promotorn och målsekvenserna vid 3′ – änden av GFP-reportern. När denna konstruktion omvandlas till celler producerar transkription från H1-promotorn shRNA, medan transkription från CMV-promotorn genererar ett GFP-sense-mål mRNA-fusionsavskrift som kan användas som reporter för screening av funktionella shRNAs.

karta över shRNA-target lentiviral reporter konstruera integrerad i genomiskt DNA och mekanism för knockdown av GFP-target reporter. Cellerna transducerade med funktionella shRNA-konstruktioner kommer att ha låga GFP-mRNA-nivåer, medan icke-funktionella shRNA tillåter en hög nivå av GFP-mRNA-uttryck.

för att optimera strukturen för shRNA konstruerade vi ett shRNA-målbibliotek i shRNA-valideringsvektorn för 150 shRNAs, med varje shRNA konstruerad i 40 olika mönster som beskrivs i litteraturen.

Vi utförde RNAi-skärmar i CHO-TRex-celler transducerade med detta 150×40 streckkodade shRNA-Målbibliotek och uppmätt representation (i biblioteket och transducerade celler) och knockdown-effektivitet för varje shRNA-konstruktion. Några representativa data från denna screening visas nedan.

de tio bästa designerna valdes utifrån de som har den högsta målknockdown-aktiviteten, lika förstärkningseffektivitet för samma design oligonukleotider, och lika representation av samma design shrnas i de poolade RNAi-biblioteken. Knockdown-effektiviteten hos tre p53 shRNAs konstruerade med dessa 10 bästa mönster i en lentiviral vektor analyserades vidare med RT-PCR efter transduktion till musfibroblastceller.