Abstrakt
Eyebright, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), är en medicinsk växt som traditionellt används i Europa för behandling av olika hälsoproblem, särskilt som ögonsköljning för att behandla ögonsjukdomar som konjunktivit och blefarit som kan associeras med bakterieinfektioner. Vissa Euphrasia-arter har tidigare rapporterats innehålla eterisk olja. Sammansättningen och bioaktiviteten hos E. rostkovianaolja är emellertid okänd. Därför undersökte vi i denna studie den kemiska sammansättningen och antimikrobiella aktiviteten hos eyebright eterisk olja mot vissa organismer associerade med ögoninfektioner: Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Pseudomonas aeruginosa och Candida albicans. GC-MS-analys avslöjade mer än 70 beståndsdelar, med n-hexadekansyra (18,47%) som huvudbeståndsdel följt av tymol (7,97%), myristinsyra (4,71%), linalool (4,65%) och anetol (4,09%). Den eteriska oljan visade antimikrobiell effekt mot alla organismer som testats med undantag av P. aeruginosa. Den bästa aktiviteten observerades mot alla grampositiva bakterier som testades med de minsta hämmande koncentrationerna av 512 kg/mL. Detta är den första rapporten om den kemiska sammansättningen av E. rostkoviana eterisk olja och dess antimikrobiella aktivitet.
1. Inledning
Eyebright, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), har använts i Europa i århundraden som en traditionell medicin för behandling av olika sjukdomar. Dekoktioner och infusioner av blommande luftdelar används mot torr hosta, heshet, symptomatisk behandling av förkylning, öronvärk och huvudvärk, hösnuva, purulent hudskada eller katarralsjukdomar i tarmkanalen, men speciellt som ögonsköljning för att behandla och förebygga ögonsjukdomar som konjunktivit, blefarit, ögonmattning, purulent okulär inflammation och sties . Användningen av eyebright-te har också rapporterats i etnoveterinärmedicin för behandling av Ko-ögoninfektion . Trots århundraden av den traditionella användningen för behandling av ögonsjukdomar har det bara genomförts en prospektiv kohortstudie som bekräftar effekten av Euphrasia ögondroppar vid behandling av konjunktivit och en enda klinisk studie som undersöker effekten av lokal applicering av ögondropparna på antibiotikakonsumtion hos nyfödda . Fram till de senaste rapporterna om anticandidal och antibakteriell aktivitet hos vissa Euphrasia-extrakt har spektrumet av antimikrobiell verkan varit helt okänt.
den terapeutiska effekten av E. rostkoviana kan huvudsakligen hänföras till dess antioxidant, antiinflammatoriska och antimikrobiella aktivitet . Bland de föreningar som tidigare identifierats i E. rostkoviana-extrakt kan apigenin , luteolin, kaempferol, quercetin, koffeinsyra, kumarinsyra och rosmarinsyra vara ansvariga för den antimikrobiella verkan. Även om närvaron av eterisk olja (EO) i E. officinalis L. och E. stricta Kunt tidigare har rapporterats är kompositionen och bioaktiviteten hos E. rostkoviana EO okänd. Därför undersökte vi i denna studie den kemiska sammansättningen och den antimikrobiella aktiviteten hos eyebright EO mot panelen av tre Gram-positiva bakterier (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus och S. epidermidis) och tre gramnegativa bakterier (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae och Pseudomonas aeruginosa) och en jäst (Candida albicans), organismer som vanligtvis är associerade med ögoninfektioner.
2. Material och metoder
2.1. Kemikalier och växtmaterial
de autentiska standarderna borneol, kamfer, carvacrol, carvone, caryophyllene, p-cymen, estragol, eukalyptol, limonen, linalool, mentol, menthone, aug.-myrcen, aug.-terpinen och tymol för identifiering av EO-komponenter samt kontrollantibiotika ciprofloxacin och tiokonazol köptes från Sigma-Aldrich (Prag, Tjeckien). Hexan (Merck, Prag, Tjeckien), dimetylsulfoxid (DMSO) (Lach-Ner, Neratovice, Tjeckien) och Tween 80 (Sigma-Aldrich, Prag, Tjeckien) användes som lösningsmedel. Växtmaterialet som användes för eo-destillationen köptes från kommersiella källor (F-DENTAL, Hodon Saborin, Tjeckien). EO extraherades genom hydrodistillation med användning av Clevenger-typapparat.
2.2. Kemisk analys av EO genom gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS)
E. rostkoviana eo analyserades med GC-MS med användning av Agilent 7890A GC kopplad till Agilent 5975C single-quadrupole massdetektor utrustad med en HP-5ms-kolonn (30 m 0,25 mm, 0,25 mm film) från Agilent (Santa Clara, CA, USA). Hexan användes som lösningsmedel och provvolymen på 1 occyl injicerades i delat läge (förhållande 20 : 1) i injektorn upphettades till 250 oc C. startugnstemperaturen sattes till 60 oc C i 3 min, programmerades till 230 oc C med en hastighet av 3 oc C/min och hölls sedan konstant i 10 min. Helium användes som bärargas med flödeshastigheten 1 mL/min. MS-analysen utfördes i fullskanningsläge och elektronjoniseringsenergin sattes till 70 eV. Identifieringen av enskilda komponenter baserades på jämförelsen av deras masspektra och relativa retentionsindex med National Institute of Standards and Technology Library (NIST, USA) och litteratur samt coinjection of authentic standard.
2.3. Bakteriestammar och odlingsmedier
standardstammarna av tre grampositiva bakterier Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213 och S. epidermidis ATCC 12228, tre gramnegativa bakterier Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 och Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 och en jäst Candida albicans ATCC 10231 erhölls från Oxoid (Basingstoke, Storbritannien). Katjonjusterad Mueller-Hintonbuljong (MHB) och sabouraud dextrosbuljong (SDB) användes som odlingsmedium för antibakteriell respektive antifungal mikrodilutionsanalys och jämvikts med Tris-buffrad saltlösning (Sigma-Aldrich, Prag, Tjeckien). Mueller-Hinton agar (MHA) och sabouraud dextros agar (SDA) användes för efterföljande bestämning av bakteriedödande respektive fungicida koncentrationer. Alla medier köptes från Oxoid (Basingstoke, Storbritannien).
2.4. Minsta hämmande koncentration (MIC) bestämning
Mic: erna bestämdes med användning av in vitro-buljongmikrodilutionsmetoden enligt riktlinjerna från Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) modifierad enligt de rekommendationer som föreslagits för effektiv bedömning av antiinfektionspotentialen hos naturliga produkter med användning av 96-brunns mikrotiterplattor. I korthet löstes EO i DMSO med tillsats av Tween 80 och tvåfaldiga seriella utspädningar bereddes i MHB för bakterier och i SDB för jästen medan de testade koncentrationerna varierade från 4 till 2048 Baccarat/mL. Inokulatet framställdes från nattkulturer så att de initiala CFU-koncentrationerna i mikroplattorna var 5 105 och 2 103 CFU/ml för bakterier respektive jäst. De inokulerade plattorna undersöktes efter 24 h inkubation vid 35 CCB och en gång till efter 48 h vid C. albicans. Den mikrobiella tillväxten mättes spektrofotometriskt av Multiscan Ascent Microplate Photometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) vid 405 nm. Mikrofonerna uttrycktes som de lägsta koncentrationerna som kunde hämma 80% av bakterietillväxten i enlighet med den positiva tillväxtkontrollen. Experimenten utfördes i tre exemplar i tre oberoende tester och medianvärden användes för beräkning av mikrofoner. På grund av den nyligen rapporterade möjligheten att eo-flyktiga komponenters inflytande på den mikrobiella tillväxten i angränsande brunnar infördes positiva tillväxtkontrollrader mellan EO-utspädningsraderna för att upptäcka eventuellt tillväxtinflytande. De använda lösningsmedlen inhiberade inte bakterietillväxten vid testade koncentrationer. Ciprofloxacin och tiokonazol användes som referensantibiotika för bakterier respektive jäst.
2,5. Minsta Baktericidkoncentration(MBC) och minsta Fungicidkoncentration (MFC) bestämning
alikvoterna på 20 oC-l överfördes från varje brunn utan mikrobiell tillväxt till mha-plattorna (SDA-plattor för C. albicans) efter 24 h och 48 h inkubation av bakterier respektive testad jäst. Plattorna inkuberades sedan i 24 timmar vid 35 kcal C. MBC och MFC utvärderades som 99,9% minskning av CFU jämfört med inokulum, alla utförda i tre exemplar i tre oberoende tester.
3. Resultat och diskussion
3.1. Kemisk karakterisering av oljor och bioaktiva fraktioner beståndsdelar
eo hydrodestillation av Clevenger-typ apparat gav 0.02% (w/v) av gulbrun olja som tenderar att stelna vid rumstemperatur som förmodligen orsakas av hög andel fettsyror (32.23% totalt). GC-MS-analys av EO avslöjade närvaron av mer än 70 beståndsdelar, med palmitinsyra (18,47%) som den vanligaste komponenten följt av tymol (7,97%), myristinsyra (4,71%), linalool (4,65%), anetol (4,09%), linolensyra (3,81%), hexahydrofarnesylaceton (3,16%), laurinsyra (2.79%), α-terpineol (2.39%), and borneol (2.39%). The main compounds are shown also in the chromatogram (Figure 1) and the complete list of EO constituents is presented in Table 1.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| R: retention indices relative to n-alkanes on HP-5MS capillary column (30 m × 0.25 mm, 0.25 m); peak area relative to total peak area in %; ID: identification method; a: identification based on mass spectra matching; b: identification based on retention index; c: identifiering baserad på coinjection av autentiskt prov; d: preliminär identifiering. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
det höga innehållet av fettsyror har tidigare hittats i E. stricta EO (25, 7% totalt) också med den högsta andelen palmitinsyra (20, 3%) och myristinsyra (3, 9%) . Det finns emellertid ingen annan förening närvarande i betydande mängd som skulle indikera förhållandet mellan dessa två Euphrasia-arter.
3.2. Antimikrobiell aktivitet
E. rostkoviana eo visade aktivitet mot sex av sju organismer som testades med mikrofoner som sträcker sig från 512 till 2048 occurg/mL. De grampositiva bakterierna var känsligare än de gramnegativa och jästen medan P. aeruginosa var den enda organismen som inte hämmades av oljan vid de högsta testade koncentrationerna. Mikrofonerna, MBC: erna och MFC: erna för EO mot alla testade mikroorganismer sammanfattas i Tabell 2. De aktiva koncentrationerna är jämförbara med de som tidigare rapporterats för till exempel EOS av Artemisia annua, Eucalyptus globulus, Mentha suaveolens, Myrtus communis, Ocimum basilicum eller Thymus vulgaris, särskilt när det gäller anticandidal aktivitet . Oljan var också effektivare än E. rostkoviana-extrakt testade av Teixeira och Silva mot E. coli, E. faecalis, S. aureus och S. epidermidis. Mic: erna för referensantibiotika mot bakterier och jäst som är mottagliga för E. rostkoviana EO var i enlighet med CLSI acceptabla gränser och tidigare rapporter, respektive .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| The growth inhibition was measured after 24 h and 48 h of incubation in case of C. albicans; EO: essential oil; CIP: ciprofloxacin; TIO: tioconazole; MIC: minimum inhibitory concentration; IC50: inhibitory concentration causing ≥50% of bacterial growth; MBC: minimum bactericidal concentration; MFC: minimum fungicidal concentration. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
eftersom innehållet i den huvudsakliga eo-beståndsdelen palmitinsyra inte överstiger 20% och det finns mer än 10 andra antimikrobiella aktiva föreningar som sträcker sig från 1 till 8% är det svårt att föreslå de huvudmedel som är ansvariga för E. rostkoviana eo antimikrobiell effekt. Palmitinsyra har tidigare identifierats som den huvudsakliga föreningen av fraktioner som är aktiva mot gramnegativa men inte grampositiva bakterier . Å andra sidan är medelkedjiga mättade fettsyror och långkedjiga omättade fettsyror kända för att hämma särskilt Gram-positiva bakterier . Dessutom utövar laurinsyra också aktivitet mot ett antal svampar . Således är den antimikrobiella aktiviteten hos EO troligen på grund av en komplex verkan av de antimikrobiella fettsyrorna med de andra välkända antimikrobiella föreningarna som identifierats i EO, såsom anetol, borneol, kamfer, karvacrol, linalool, mentol, XXL-terpineol eller tymol.
4. Slutsatser
Sammanfattningsvis avslöjade den kemiska analysen ett antal antimikrobiella aktiva substanser som finns i E. rostkoviana EO och dess antifungala och antibakteriella aktivitet mot Gram-positiva såväl som gramnegativa bakterier bekräftades. Så vitt vi vet är detta den första rapporten om E. rostkoviana EO: s sammansättning och antimikrobiella aktivitet.
intressekonflikt
författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt när det gäller publiceringen av detta dokument.
erkännanden
detta arbete stöddes ekonomiskt av Europeiska Vetenskapsstiftelsen och ministeriet för utbildning, ungdom och idrott i Tjeckiens projekt CZ.1.07/2.3.00/30.0040; av s-bidrag från ministeriet för utbildning, ungdom och idrott i Tjeckien; och av tjeckiska University of Life Sciences Prague Project Iga 20155012. Författarna är tacksamma för Slavka Barlakova för engelsk korrekturläsning.