4.2.1 polymeras II

även om transkription uppsägning har varit mycket mindre utforskas än dess initiering, de senaste 25 åren har visat att den väl tidsinställda och exakt frisättning av begynnande transkript och RNA-polymeraser från DNA-mallen är avgörande för öde RNA samt för övergripande genom underhåll.

senare arbete avslöjade att Rat1 i jäst och Xrn2 hos människor var ansvariga för torpedaktiviteten och att brist på antingen enzym, liksom Rat1-aktivatorn Rai1 i jäst, leder till en termineringsfel, som manifesterar sig som en omfattande transkriptionsläsning. Det är också möjligt att en växt Rat1 homolog, Arabidopsis AtXRN3, fungerar som en transkriptionsavslutningsfaktor på samma sätt som Rat1/Xrn2. Hög genomströmningsmetoder avslöjade en ackumulering av icke-kodande transkript från 3′-änden av mRNA och mikroRNA (miRNA) gener i xrn3 knockdown mutant, vilket kan motsvara transkriptionella genomläsningsmolekyler . Således kan AtXRN3 delta i en global RNA 3′-end-övervakning som ett resultat av dess torpedavslutningsaktivitet.

torpedmekanismen beror på den exonukleas katalytiska aktiviteten hos Rat1, och inte bara på dess närvaro . Det monofosforylerade RNA-substratet för Rat1 / Xrn2 under mRNA-syntes genereras som ett resultat av en cotranscriptional cleavage (CoTC) vid polyadenyleringsstället av mRNA 3′-end formation machinery. Mer exakt utförs denna process av ysh1-komponenten i CF II i jäst eller motsvarande CPSF-73-subenhet av den mänskliga klyvnings-och polyadenyleringspecificitetsfaktorn (CPSF) (granskad i Ref. ). Två faktorer föreslogs för att bidra till effektiv uppsägning: styrkan hos poly(a) – signalen och verkan av exonukleasnedbrytande 5′ – klyvningsprodukten, vilket underlättar paus av polymeraset nedströms poly (A) – platsen och främjar dess frisättning . Å andra sidan avskaffar nedsatt Rat1-beroende uppsägning inte korrekt poly(a)-sitigenkänning och mRNA-klyvning .

ytterligare Inträdesställen för Rat1 / Xrn2 kan uppstå genom autokatalytisk CoTC nedströms poly(A) – platsen i däggdjur eller endonukleolytisk klyvning av Rnt1 i jäst . Det senare fallet rapporterades som en felsäker avslutningsmekanism för proteinkodande gener, som tillsammans med vägen medierad av nrd1/Nab3/Sen1-komplexet (NRD) ger ett backupläge för Pol II-frisättning.

Även om Rat1 / Xrn2 krävs för effektiv Pol II-avslutning, misslyckas Rat1 med att utlösa avslutning in vitro och dess 5′ -3 ’ nedbrytningsaktivitet är inte tillräcklig för att främja polymerasdissociation in vivo. Konsekvent, jäst Xrn1 riktad mot kärnan kan cotranscriptional nedbrytning av begynnande RNA men räddar inte termineringsfel orsakade av en Rat1-brist. Dessa observationer tyder på att exonukleaset som fångar upp polymeraset är nödvändigt men inte tillräckligt för att destabilisera förlängningskomplexet och att ett ytterligare element i torpedmekanismen fungerar under uppsägning. Det har postulerats att en Rat1-unik egenskap, den utökade torndomänen, som inte finns i xrn1-proteiner, kan vara ansvarig för dess termineringsegenskaper . Det är tänkbart att torndomänen genomgår vissa modifieringar eller fungerar som ett gränssnitt för interaktioner med termineringsförbättrande faktorer. En av de möjliga kandidaterna för faktorer som stimulerar Rat1-beroende terminering är RNA-helikas Sen1, som är en nyckelkomponent i termineringsvägen för icke-kodande RNA i jäst (se nedan) som också bidrar till avslutningen av proteinkodande gener, med den starkaste effekten på kortare mRNA . Sen1 interagerar via sin N-terminala domän med den största Pol II-subenheten, Rpb1 och försämrad Sen1-helikasaktivitet försämrar Genomomfattande Pol II-distribution över kodande och icke-kodande gener . Den mänskliga sen1-homologen, Senataxin, visade sig direkt främja xrn2-medierad transkriptionsterminering genom att lösa RNA:DNA-hybrider (R-loopar) bildade bakom den långsträckta Pol II, övervägande vid g-rika pausställen nedströms poly(a) – platsen . Denna aktivitet underlättar åtkomsten av Xrn2 till Poly (a) site 3’ – klyvningsprodukter och bidrar därmed till rekryteringen av torpedexonukleas. Verkningsmekanismen för jäst Sen1 anses vara liknande .

en obesvarad fråga är hur Rat1 rekryteras till det långsträckta polymeraset. Flera observationer stöder Rat1-förening via proteiner som interagerar med Pol II C-terminal domän (CTD) genom deras CTD-interagerande domän (CID), nämligen Pcf11-underenheten av jästklyvningsfaktorn IA (CFIA) och Rtt103 (regulator för Ty1-införlivande 103). Rat1 och Rai1 är närvarande vid promotorerna och kodande regioner med en stark anrikning vid 3′-ändarna av gener. Den funktionella interaktionen mellan Rat1 och Pcf11 visade sig underlätta ömsesidig corecruitment av båda faktorerna: Rat1 länkar uppsägning till 3′-end-bildningen genom att stimulera rekryteringen av 3′ – end-bearbetningsfaktorer, särskilt CFIA-underenheterna Pcf11 och Rna15, medan Pcf11 bidrar till Rat1-associering över poly(A) – platsen . Också, humant Pcf11 visades för att förbättra nedbrytning av begynnande RNA och främja transkription avslutning . I sin tur kopurifierar Rtt103, som också associerar nära 3′-ändarna av gener, med Rat1, Rai1 och Pcf11, och tillsammans med Pcf11 känner igen den Ser2-fosforylerade CTD av den långsträckta Pol II . Å andra sidan förändras inte Rat1-fördelningen över gener i frånvaro av Rtt103 . Dessutom avslutar Rat1 också transkription av Pol i, som saknar en CTD, vilket tyder på att Rat1-rekrytering också kan ske via andra mekanismer. Faktum är att föreningen av hXrn2 rapporterades medieras av p54nrb / PFS (proteinassocierad skarvningsfaktor), som är multifunktionella proteiner involverade i transkription, skarvning och polyadenylering . Rollen av p54nrb / PFS i Pol II transkription uppsägning visades också i C. elegans.

förutom mRNA syntetiserar Pol II ett brett spektrum av icke-kodande transkript, inklusive små nukleära RNA och snarnor och en mängd instabila rna. I jäst avslutas transkriptionen av dessa relativt korta arter huvudsakligen av ett alternativt NRD-komplex, sammansatt av RNA-bindande proteiner Nrd1 och Nab3 och det ATP-beroende helikas Sen1 . Eftersom denna mekanism sannolikt inte medför en cotranscriptional endonukleolytisk klyvning, är det Sen1 RNA:DNA-hybrid–avvecklingsaktivitet som anses vara väsentlig för polymerasdissociation, kanske på ett sätt som liknar bakteriellt Rho-DNA-RNA-helikas. Rho destabiliserar förmodligen förlängningskomplexet genom att translokera längs och ta bort det framväxande RNA från polymeraset . En alternativ allosterisk modell posits att Rho laddar på polymeras och inducerar omarrangemang i enzymet aktivt ställe vid termineringsställen . Båda handlingssätten kan väl ansöka om Sen1-helikas.

Även om Rat1 rekryteras till snoRNA-gener, särskilt introniska, är NRD-beroende uppsägning av snoRNA-transkript inte nedsatt när det saknas, och det föreslogs därför att det deltar i vissa för tidiga avslutningshändelser . Det är fortfarande möjligt, dock, att Rat1 torped mekanism kan bidra till transkription uppsägning av snarnor, såsom U3 eller snR40, vars 3′-end frigörs genom rnt1 klyvning som exponerar den återstående begynnande transkript 5′-end för Rat1 attack .