cytopatisk effekt (CPE): hur kommer virus undan med mord

virus är per definition osynliga för våra ögon. De är nanostrukturer som bara kan bli synliga med elektronmikroskopi, en teknik som är tidskrävande och inte tillgänglig för alla. Som en konsekvens måste en virolog hitta alternativ för att kunna arbeta och studera sitt intresseobjekt. Ett praktiskt sätt att” se ” och indirekt mäta en virusinfektion är genom att titta på den skada ett virus orsakar en cell. Detta lidande eller skada kallas cytofatisk effekt (CPE) och dess mätning används ofta i virologilaboratorier över hela världen.

CPE är ett mycket grundläggande tillvägagångssätt för att förstå hur ett virus infekterar en cell, men det betyder inte att det bara används i grundläggande vetenskaplig forskning. Mätning av CPE kan också vara en mycket användbar avläsning för läkemedelsföretag och diagnostiska laboratorier.

vad är virusinducerad cytofatisk effekt?

virus är parasiter som behöver en värdcell för att replikera. En gång inuti cellen kapar de cellulära maskiner för att producera sina egna proteiner, nukleinsyra och membran (vid behov).

eftersom viruset upptar cellulära faktorer som annars används av cellen, kan dess replikering ändra värdcellernas grundläggande funktioner eller till och med förstöra det. Uppsättningen av cellförändringar eller förändringar till följd av en virusinfektion kallas CPEs. Dessa är vanligtvis negativa förändringar som kan orsaka strukturella, metaboliska eller funktionella modifieringar i cellen som smittas. Med tiden kan CPE ge upphov till de patologiska effekterna av viruset (sjukdomen).

klassiska exempel på den cytopatiska effekten

en välkänd virusinducerad-CPE är celldöd (kolla in en video av en döende cell i ). Många virus dödar celler antingen genom lys eller genom att inducera apoptos. Till exempel är HIV känt för att döda CD4+ T-lymfocyter, vilket är den främsta anledningen till att infekterade individer blir immunkompromitterade.

i laboratoriet är ett enkelt sätt att döda en myggcellinje (som C6/36) eller Vero-celler genom att infektera det med något känt arbovirus, som Chikungunya, dengue eller Zika. Efter några dagars infektion faller cellerna bara ihop precis framför dina ögon (Fig. 1).

Figur 1 | Vero-celler infekterades med Zika-virus. Efter 72 h infektion är en klar CPE uppenbar genom närvaron av celldebri som ett resultat av celldöd.

ett annat CPE-exempel är syncytibildning. Celler infekterade av höljeförsedda virus uttrycker virala proteiner på deras plasmamembran, som används av virus för att förmedla fusion med värdcellen. När dessa virala proteiner binder till receptorer på ytan av angränsande celler sker cellcellfusion, vilket resulterar i syncytibildning (multinucleated giant cell).

respiratoriskt syncytialvirus (RSV) är den främsta orsaken till viral lunginflammation hos små barn. Dess namn härrör från det faktum att det kan bilda syncyti i cellodling men anmärkningsvärt också i lungorna hos infekterade patienter.

CPE-relaterade förändringar i cellmorfologi inkluderar också avrundning, lossning och/eller klumpning av vidhäftande celler. I detta fall förblir infekterade celler metaboliskt aktiva för att replikera viruset, men deras cytoskelett förändras. De morfologiska förändringarna kan förklaras av en nedreglering av uttrycket av ytvidhäftningsproteiner som ett resultat av infektion. Ebolavirus, till exempel, är känt för att orsaka dramatiska morfologiska förändringar i vidhäftande celler genom att minska uttrycket av integrinet 21.

behöver du verkligen så mycket drama (död, gigantism, deformation) för att det ska betraktas som en CPE? Nej. Celler kan bara ”bete sig” annorlunda när de smittas, men ser likadana ut. Mer subtil men fortfarande tydlig CPE-typ av förändringar kan inkludera förändring av tillväxthastighet/kinetik, förändringar i en given metabolisk aktivitet eller förändringar i cellfunktionen. Bland de olika virus som kan inducera dessa typer av CPEs står Zika virus. År 2015 var detta myggöverförda virus över nyheterna eftersom det orsakar mikrocefali, en allvarlig neurologisk skada som kännetecknas av en minskad hjärnstorlek hos foster. Senare beskrevs att mikrocefali är resultatet av flera Zika-inducerade cytopatiska effekter på neurala celler, inklusive cellhypertrofi, tillväxtbegränsning, cellcykeldysregulering och celldöd. En kolonibildningsanalys användes till exempel för att identifiera vilka av de olika Zika-proteinerna som stör cellproliferation.

för forskare som systematiskt jämför tillväxtkinetiken hos cellinjer rekommenderar vi CytoSMART Omni. Kinetisk live-cell avbildning av hela brunnar, med hjälp av automatiserad skanning och bild sömmar programvara. Bild fullbrunnsplattor i timmar till veckor i taget.

cytopatiska effekter är resultatet av virus-värdinteraktioner

det är viktigt att nämna att CPE inte bara definieras av viruset utan också av värdcellen. Det är beroende av hur tillåtna cellerna är för infektion. Att vara en permissiv cell, en som kan stödja tillväxten av ett virus. Med andra ord kan inte alla virus infektera alla celltyper. För att hålla det enkelt kan vi säga att:

• inte tillåtet cellvirus kan inte infektera
• tillåtet cellvirus kan replikera, men orsakar inte uppenbar CPE
• mycket tillåtet cellvirus replikerar och inducerar en uppenbar CPE

så om du lägger till virus i dina celler och ingenting händer, oroa dig inte. Du behöver bara hitta rätt viruscellkombination.

avläsningar – hur mäter man CPE?

Virusinducerade cellulära förändringar som celldöd eller en förändrad morfologi är synliga genom ljusmikroskopi. Du kan bara sätta din tallrik under ett vanligt inverterat mikroskop och se om dina celler dog eller på något sätt ändrats. En positiv aspekt av detta tillvägagångssätt är att det är ”lätt” eftersom det inte kräver någon bearbetning av provet, vilket undviker fixering eller färgning av artefakter.

på nackdelen är det kvalitativt och inte kvantitativt, och det är starkt beroende av observatörens träning. Numera kan detta tillvägagångssätt automatiseras genom att göra realtidsövervakning av virusinducerad cytopatogenes. Till exempel kan virusförändringar av cellspridning och proliferation bedömas genom en sårläkningsanalys, där minskad kollektiv och enkelcellsmigrationshastighet kan detekteras tillsammans med allvarliga förändringar i cellmorfologi. Ett annat kvantitativt tillvägagångssätt är övervakningen av cellproliferation genom automatiserad bildanalys. Med denna teknik är det möjligt att generera tillväxtkurvor för infekterade vs. icke-infekterade cellkulturer för att korrekt kvantifiera den cytopatiska effekten som en virusinfektion kan ha.

om dödsceller är det som gör din dag, är ett alternativ den berömda Plackanalysen. Denna klassiska virologiteknik används för att kvantifiera infektiösa viruspartiklar och den bygger på principen att virus kan inducera celllys. Efter att ha infekterat ett monoskikt av mycket permissiva celler, är cellerna motfärgade med kristallviolett (levande celler är färgade, dödsceller förblir ofärgade), vilket resulterar i vackra plack (områden av dödsceller) som lätt kan kvantifieras med blotta ögat.

men du behöver inte se dina celler för att veta att de är döden. Cellviabilitet efter infektion kan mätas genom att kvantifiera intracellulär ATP-koncentration med firefly luciferas eller med den traditionella MTT-analysen.

att arbeta med virus kan vara jobbigt, BSL-3/4 labs har strikta säkerhetsåtgärder och att komma in och ut ur labbet tar mycket tid. För forskare som letar efter en lösning för att övervaka sina celler, utan att behöva gå in i labbet rekommenderar vi att du tittar på CytoSMART Lux2 Duo Kit.

applikationer

är ditt virus inducerande en CPE? Kan du tydligt se eller mäta det? Toppen! Du kan använda denna CPE som avläsning av en framgångsrik virusinfektion eller replikering. En given CPE kan fungera som en indikator för att ta reda på hur man förhindrar en infektion, för att karakterisera värd-eller patogenfaktorer som krävs för att en infektion ska äga rum, för att identifiera virustropism, bland andra. I praktiken innebär detta att det kan användas som avläsning för:

• Screening och utvärdering av antiviral förening
  kan en läkemedelskandidat förhindra CPE-bildning?
• Screening för neutraliserande antikroppar
  kan en given antikropp hämma virusinducerad CPE?
• övervakning av antiviral läkemedelsresistens (fenotypning)
  kan ett givet virusisolat inducera CPE i närvaro av antivirala läkemedel?
• karakterisering av virus tropism
  vilka celltyper är företrädesvis infekterade av ett virus? Varför? (Kolla en ny publikation med den ökända SARS-CoV-2 i .)
• diagnos av virussjukdomar
  är ett virus som aktivt infekterar en person? Är det kliniska provet som samlas in från den personen som inducerar CPE? Låt oss komma ihåg att de flesta diagnostiska metoder (ELISA, RT-qPCR) inte upptäcker infektiösa viruspartiklar.

För att avsluta…

Även om det finns flera sätt att mäta virusinfektion, kvarstår kontroll av CPE i tillåtna celler som ett allmänt använt alternativ. För att det ska vara riktigt användbart måste du hitta rätt kombination: ett virus, en tillåten cell och en exakt avläsning. När du väl har hittat denna kombination kan applikationerna vara ganska olika och användbara antingen i akademisk miljö, inom industrin eller i klinisk diagnostik.

Läs om alla CytoSMART imaging-lösningar här