Michelle Dotzert, PhD
¿Cuál es la diferencia entre una Transferencia Sur, Norte y Oeste?
Se utilizan diferentes técnicas de borrado para identificar proteínas únicas y secuencias de ácidos nucleicos. Los protocolos Southern, northern y western blot son similares, y comienzan con la separación electroforética de fragmentos de proteínas y ácidos nucleicos en un gel, que luego se transfieren a una membrana (membrana de nitrocelulosa, membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF), etc.) donde están inmovilizados. Esto permite que las sondas de adn o anticuerpos radiomarcados o etiquetados enzimáticamente se unan al objetivo inmovilizado, y las moléculas de interés se pueden visualizar con varios métodos. Las técnicas de borrado se seleccionan en función de la molécula diana: ADN, ARN o proteína. (Figura 1, cuadro 1).
Southern Blot
Los Southern blots se utilizan para determinar la identidad, el tamaño y la abundancia de secuencias de ADN específicas. El protocolo southern blot comienza con la extracción de ADN de las células o tejidos, que luego se digiere enzimáticamente para producir fragmentos de ADN. Los fragmentos se separan por tamaño en un gel de agarosa o poliacrilamida mediante electroforesis. Los fragmentos más pequeños migrarán más lejos en el gel que los más grandes. Después de la electroforesis, el ADN del gel se transfiere a una membrana de nylon. La membrana se incuba con una sonda de ácido nucleico que tiene una secuencia homóloga a la secuencia objetivo y está etiquetada con radiactividad, tinte fluorescente o una enzima capaz de generar una señal quimioluminiscente. La hibridación de secuencias complementarias ocurre durante la incubación, y la sonda sin hibridar se elimina lavando con tampón. Las moléculas de sonda etiquetadas completamente hibridadas permanecerán unidas a la mancha. Los métodos de detección difieren según la etiqueta de la sonda; las sondas radiomarcadas se visualizan con película de rayos X o fosforimagen, y las sondas etiquetadas enzimáticamente se visualizan con sustrato quimioluminiscente.
Protocolo Southern blot
- Aislamiento de ADN
- Digestión de restricción: digiera el ADN con una enzima de restricción y, si es necesario, concentre el ADN digerido.Electroforesis en gel: prepare un gel de agarosa y un tampón TAE o TBE (la selección del tampón dependerá de la duración del ciclo y del tamaño de los fragmentos de ADN). Cargue las muestras en pozos e incluya un marcador de peso molecular de ADN. Ejecutar el gel.
- Transferir:
- Colocar el gel en un recipiente con solución desnaturalizante y lavar dos veces durante 15 minutos en un agitador.
- Enjuague con agua, luego lave con solución de neutralización.
- Durante el paso anterior, comience a preparar el papel Whatman y la membrana de nailon para la transferencia.
- Ensamble el aparato de transferencia con la membrana, el papel Whatman y el gel y transfiera en tampón SSC o SSPE.
- Cuando se complete la transferencia, haga un enlace cruzado de ADN en un enlace cruzado, luego enjuague la membrana.
- Pre-hibridación (bloqueo):el bloqueo
- reduce la unión no específica a la membrana. Prepare la solución de pre-hibridación y agregue muestras de ADN. Retire la mancha del enlazador cruzado, agregue la solución de pre-hibridación e incube.
- Hibridación:
- Prepare la mezcla de sonda (una hebra de ADN complementaria) y el tampón.
- Retire la solución de pre-hibridación e incube la mancha con la sonda (los tiempos de incubación variarán según la aplicación).
- Después de la incubación, realice un lavado de bajo rigor seguido de un lavado de alto rigor para refinar el ADN.
- Detección de sonda:
- Enjuague la membrana, transfiera a un recipiente con solución de bloqueo e incube.
- Desechar la solución bloqueante, sustituirla por solución de anticuerpos e incubar.
- Deseche la solución de anticuerpos, lave la membrana.
- Siga las instrucciones del fabricante para la detección de quimioluminiscencia.
Northern Blot
Northern blot se utiliza para determinar la identidad, el tamaño y la abundancia de determinadas secuencias de ARN. Los protocolos Northern blot comienzan con el aislamiento del ARN, y las técnicas de separación varían dependiendo del tamaño del ARN. Los ARN grandes se separan mediante electroforesis en un gel de agarosa de formaldehído o gel de agarosa glioxal, que impide el pelado normal de la base y mantiene el ARN en un estado desnaturalizado. Los ARN pequeños se separan en un gel de poliacrilamida desnaturalizante (urea). El ARN se transfiere del gel a una membrana de nylon que se incuba con una sonda de ARN, ADN u oligodeoxinucleótido marcada radiactivamente o no isotópicamente. La sonda sin hibridar se retira lavando con tampón. Las sondas radiomarcadas se visualizan con película de rayos X, y las sondas etiquetadas enzimáticamente se visualizan con quimioluminiscencia.
Protocolo Northern blot
- Aislamiento de ARN
- Electroforesis:
- Para un gel de agarosa de formaldehído: prepare el gel e inserte la bandeja de gel en el aparato. Rellene con tampón de trapeadores, cargue las muestras e incluya un marcador de peso molecular. Pasa el gel y luego recorta el gel antes de secarlo.
- Para un gel de agarosa glioxal: prepare el gel e inserte la bandeja de gel en el aparato. Llene con tampón de trapeadores, prepare las muestras y cargue en los pozos junto con la escalera de ARN.
- Para un gel de poliacrilamida desnaturalizante: fundir el gel y montarlo en la unidad de electroforesis. Prepare las muestras, cargue en el gel y ejecute con el búfer de ejecución TBE.
- Transferencia:
- Para un gel de agarosa de formaldehído o gel de agarosa glioxal: lave el gel en SSC, luego monte la unidad de transferencia con el gel, el papel de filtro y la membrana de nylon. Cuando se complete la transferencia, coloque la membrana en un reticulador UV.
- Para un gel de poliacrilamida desnaturalizante: ensamble la unidad de transferencia, incluyendo gel, papel de filtro y membrana de nailon, asegurándose de que estén inundados con TBE. Cuando se complete la transferencia, coloque la membrana en un reticulador UV para fijar el ARN a la membrana.
- Pre-hibridación (bloqueo):
- Pre-hibridar la membrana en solución de hibridación.
- Hibridación:
- Añadir sonda en la solución de hibridación e incubar.
- Lave la membrana en lavados de bajo rigor para eliminar la solución de hibridación y la sonda sin hibridar, y en lavados de alto rigor para eliminar moléculas parcialmente hibridadas.
- Siga las instrucciones del fabricante para la detección de quimioluminiscencia.
Western Blot
Western blot se utiliza para determinar la identidad, el tamaño y la abundancia de proteínas específicas en una muestra. El protocolo de western blot comienza con la preparación de muestras de lisado a partir de cultivos de tejidos o células y la separación en un gel de poliacrilamida a través de electroforesis. Las proteínas separadas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa o difluoruro de polivinilideno (PVDF). La membrana se incuba con un agente bloqueante para evitar la unión inespecífica, seguida de la incubación con un anticuerpo primario para unirse a la proteína de interés. Hay dos métodos de detección, directos e indirectos. La detección directa (Figura 2) se basa en un anticuerpo primario marcado, mientras que la detección indirecta requiere un anticuerpo primario dirigido contra la proteína diana y un anticuerpo secundario dirigido contra la clase o subclase de inmunoglobina de la especie del anticuerpo primario (Figura 3). Los métodos de visualización incluyen ensayos colorimétricos en los que se produce un precipitado coloreado, quimioluminiscencia y fluorescencia.
Protocolo Western blot
- Preparar lisado a partir de cultivo celular o tejido.
- Preparación de la muestra:
- Determinar la concentración de proteínas de cada muestra con un ensayo de cuantificación de proteínas (es decir. Ensayo Bradford).
- Agregue un volumen igual de 2X búfer de muestra Laemmli a cada muestra.
- Algunas muestras pueden necesitar ser reducidas o desnaturalizadas, esto se logra hirviendo muestras en tampón.
- Electroforesis:
- Prepare un gel SDS-PAGE, cargue las muestras junto con el marcador de peso molecular.
- Ejecute el gel en el búfer de ejecución.
- Transferencia:
- Después de la electroforesis, monte la unidad de transferencia, incluida la membrana de gel, PVDF o nitrocelulosa, y el papel de filtro.
- Transfiera las proteínas a la membrana con un tampón de transferencia.
- Tinción de anticuerpos (detección indirecta):
- Preparar tampón de bloqueo e incubar la membrana para reducir la unión no específica.
- Incubar la membrana con anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo.
- Lavar la membrana en TBST e incubar con anticuerpo secundario conjugado diluido en tampón de bloqueo.
- Lave la membrana en TBST.
- Siga las instrucciones del fabricante para la detección de quimioluminiscencia.