Expedición a Sudamérica
En Humboldt había crecido la convicción de que su verdadero objetivo en la vida era la exploración científica, y en 1797 renunció a su puesto para adquirir con gran determinación un conocimiento profundo de los sistemas de mediciones geodésicas, meteorológicas y geomagnéticas. Los trastornos políticos causados por las Guerras napoleónicas impidieron la realización de varias expediciones científicas en las que Humboldt había tenido la oportunidad de participar. Finalmente, desanimado por sus decepciones, pero negándose a ser disuadido de su propósito, obtuvo el permiso del gobierno español para visitar las colonias españolas en América Central y del Sur. Estas colonias eran entonces accesibles solo a los funcionarios españoles y a la misión Católica romana. Completamente desconectados del mundo exterior, ofrecían enormes posibilidades a un explorador científico. La posición social de Humboldt le aseguró el acceso a los círculos oficiales, y en el primer ministro español Mariano de Urquijo encontró a un hombre ilustrado que apoyaba su solicitud al rey para un permiso real. En el verano de 1799 zarpó de Marsella acompañado por el botánico francés Aimé Bonpland, a quien había conocido en París, entonces el centro científico más animado de Europa. La finca que había heredado a la muerte de su madre permitió a Humboldt financiar la expedición totalmente de su propio bolsillo. Humboldt y Bonpland pasaron cinco años, de 1799 a 1804, en América Central y del Sur, cubriendo más de 6,000 millas (9,650 km) a pie, a caballo y en canoas. Fue una vida de gran esfuerzo físico y graves privaciones.
A partir de Caracas, viajaron hacia el sur a través de pastizales y matorrales hasta llegar a las orillas del Apure, un afluente del río Orinoco. Continuaron su viaje por el río en canoa hasta el Orinoco. Siguiendo su curso y el del Casiquiare, demostraron que el río Casiquiare formaba una conexión entre los vastos sistemas fluviales del Amazonas y el Orinoco. Durante tres meses, Humboldt y Bonpland se movieron a través de densos bosques tropicales, atormentados por nubes de mosquitos y sofocados por el calor húmedo. Sus provisiones pronto fueron destruidas por los insectos y la lluvia; la falta de comida finalmente los llevó a subsistir con granos de cacao silvestres y agua de río. Sin embargo, ambos viajeros, animados por la emoción proporcionada por las nuevas y abrumadoras impresiones, permanecieron sanos y en el mejor de los espíritus hasta su regreso a la civilización, cuando sucumbieron a un severo ataque de fiebre.
Después de una corta estancia en Cuba, Humboldt y Bonpland regresaron a Sudamérica para una extensa exploración de los Andes. De Bogotá a Trujillo, Perú, vagaron por las Tierras Altas Andinas, siguiendo una ruta que ahora atraviesa la Carretera Panamericana, en su tiempo una serie de senderos empinados, rocosos y a menudo muy estrechos. Escalaron una serie de picos, incluidos todos los volcanes en los alrededores de Quito, Ecuador; el ascenso de Humboldt al Chimborazo (20,702 pies ) a una altura de 19,286 pies (5,878 metros), pero a la altura de la cumbre, siguió siendo un récord mundial de escalada de montañas durante casi 30 años. Todos estos logros se llevaron a cabo sin la ayuda de equipos modernos de montañismo, sin cuerdas, crampones ni suministros de oxígeno; por lo tanto, Humboldt y Bonpland sufrieron mal de montaña. Pero Humboldt aprovechó su incomodidad: se convirtió en la primera persona en atribuir el mal de montaña a la falta de oxígeno en el aire enrarecido de las grandes alturas. También estudió la corriente oceánica de la costa oeste de América del Sur que originalmente recibió su nombre, pero que ahora se conoce como la Corriente del Perú. Cuando la pareja llegó a Quito, desgastado y lleno de pies, Humboldt, el montañero experimentado e incansable coleccionista de datos científicos, no tuvo dificultad en asumir el papel de cortesano y hombre de mundo cuando fue recibido por el virrey y los líderes de la sociedad española.
En la primavera de 1803, los dos viajeros navegaron de Guayaquil a Acapulco, México, donde pasaron el último año de su expedición en un estudio detallado de esta parte más desarrollada y altamente civilizada de las colonias españolas. Después de una corta estancia en los Estados Unidos, donde Humboldt fue recibido por el Presidente estadounidense. Thomas Jefferson, navegaron hacia Francia.
Humboldt y Bonpland regresaron con una inmensa cantidad de información. Además de una vasta colección de plantas nuevas, se realizaron determinaciones de longitudes y latitudes, mediciones de los componentes del campo geomagnético de la Tierra y observaciones diarias de temperaturas y presión barométrica, así como datos estadísticos sobre las condiciones sociales y económicas de México. Cada vez que Humboldt se encontraba en un centro de comercio en América, enviaba informes y duplicados de sus colecciones a su hermano Wilhelm, que se había convertido en un destacado filólogo, y a científicos franceses; desafortunadamente, el bloqueo continental impuesto por los barcos británicos impidió que la mayor parte de su correo llegara a su destino.