Endotelio
El endotelio corneal constituye la capa más interna de la córnea, separándola del humor acuoso en la cámara anterior del ojo (Fig. 61.1). El endotelio consiste en una sola capa (aproximadamente 4 µm) de células epiteliales escamosas, que se caracterizan por la expresión distintiva de bombas de iones como Na+/K+/ATPasa y proteínas de unión estrecha como ZO-1 (Tabla 61.1). Esta capa sirve como barrera para mantener el estado de deshidratación corneal adecuado a través de un mecanismo de fuga de bomba .
La pérdida o disfunción de las células endoteliales de la córnea (CEC) crea una acumulación excesiva de líquido en la córnea, lo que resulta en inflamación progresiva, desorganización del estroma, transparencia reducida y deterioro de la visión . Las principales causas de pérdida y disfunción endotelial de la córnea son la distrofia endotelial, el traumatismo/cirugía o la uveítis anterior crónica. La distrofia endotelial corneal de Fuchs y la distrofia endotelial hereditaria congénita se encuentran entre las distrofias endoteliales corneales más comunes causadas por mutaciones genéticas y factores ambientales potenciales . Otra causa frecuente de distrofia endotelial, la queratopatía bullosa pseudofáquica, es inducida por el daño al endotelio durante la cirugía de cataratas. La diabetes y el envejecimiento también son factores de riesgo importantes para la pérdida endotelial de la córnea.
A diferencia de las células epiteliales que pueden repararse por proliferación, los CEC adultos tienen una capacidad proliferativa limitada. En cambio, las células endoteliales tienden a repararse deslizándose hacia el área de la lesión y el agrandamiento de las células adyacentes. Aunque este mecanismo mantiene la barrera endotelial corneal después de la lesión, también reduce la densidad de las células endoteliales y altera su morfología hexagonal y su capacidad de bombeo. Cuando la reducción de la densidad celular alcanza un rango de 500-1000 células/mm2 o menos, la única opción terapéutica disponible es el trasplante de córnea parcial o completo . En la actualidad, el trasplante de córnea por pérdida endotelial representa el 60% de todos los trasplantes de córnea realizados en los Estados Unidos .
Para superar la escasez de donantes de tejido corneal descrita anteriormente, los esfuerzos iniciales se han centrado en el aislamiento y la expansión ex vivo de los CEC primarios. La primera cultura exitosa de CECs humanos fue reportada en 1965 . Desde entonces, se han desarrollado varias modificaciones en técnicas de aislamiento, sustratos de matriz extracelular y medios de cultivo para superar la limitada capacidad de propagación de las células y la pérdida del fenotipo CEC en cultivo . Por ejemplo, Okumura et al. se examinó la expresión de diferentes isoformas de laminina en la córnea y se identificó la laminina-511 y 521 como las formas de laminina predominantes en la DM adulta . Utilizando estas dos lamininas como sustrato para el cultivo in vitro de CEC humanos, lograron mejorar significativamente la unión, la supervivencia y la expansión de los CEC . Otros grupos han intentado cultivar CECs humanos en DMs derivados de donantes humanos como sustratos. La ventaja de este enfoque es que imita el entorno corneal in vivo para lograr un mantenimiento y crecimiento adecuados de la CIC . La importancia de la DM para apoyar la expansión de la CIC también fue confirmada por un estudio reciente realizado en un modelo de lesión endotelial corneal de conejo. A través de esto, se demostró que la ausencia de DM perjudica la migración de la CIC nativa y la regeneración de la córnea .
A pesar de las ventajas, el uso de andamios complica la entrega en la córnea, lo que requiere procedimientos quirúrgicos elaborados. Un enfoque mucho más simple sería administrar CECs en suspensión celular. La inyección de células en suspensión permitiría métodos de fabricación más simples y teóricamente menos invasivos . Sin embargo, este enfoque aumenta el riesgo de eliminación de las células inyectadas por el flujo de humor acuoso, limitando la supervivencia celular y el injerto en la córnea. Dos métodos desarrollados para mejorar la entrega de suspensiones celulares en el endotelio corneal incluyen el uso de la entrega guiada por campo magnético y la coinyección de células con un inhibidor de ROCA. Para la entrega de células magnéticas, los CEC se etiquetan con partículas magnéticas y se entregan en el lugar apropiado en la superficie corneal posterior con la ayuda de un imán externo . En un ejemplo reciente, los CEC fueron etiquetados con nanopartículas superparamagnéticas e inyectados en la cámara ocular anterior de conejos adultos con lesión por CEC. De manera similar a la CIC nativa, las células inyectadas formaron una monocapa y restauraron la transparencia corneal sin efectos adversos . Alternativamente, Okumura et al. se utilizó coinyección de CEC con el inhibidor de ROCA Y27632 para mejorar la supervivencia y proliferación de CEC. Este enfoque resultó en un mejor injerto de las células y una mejor recuperación de la transparencia corneal en un modelo de lesión corneal en conejo . Estos efectos beneficiosos se confirmaron en un modelo de distrofia endotelial corneal en monos , lo que llevó al inicio de estudios clínicos en humanos. En 2018, el mismo grupo informó de los resultados del trasplante de CEC, en combinación con un inhibidor de ROCA, en 11 pacientes de queratopatía bullosa; más del 80% de los pacientes tratados mostraron recuperación del grosor de la córnea y mejora de la agudeza visual 24 semanas después del tratamiento . Este estudio proporcionó la primera evidencia clínica de que el trasplante mínimamente invasivo de CECs humanos cultivados puede utilizarse como una nueva opción terapéutica para tratar la disfunción endotelial corneal. Al mismo tiempo, planteó preguntas sobre el desarrollo futuro de este enfoque. Estos incluyen la necesidad de determinar un rango de edad adecuado para la producción de CEC trasplantables de alta calidad, la contribución mecánica del inhibidor de ROCA a los resultados clínicos, la dosificación precisa de las células para equilibrar la eficacia y la seguridad, y el desarrollo de un medio para rastrear el destino de las células liberadas después del trasplante . Además, la limitada disponibilidad de CEC de donantes de alta calidad y la limitada capacidad de las células para expandirse in vitro están deteniendo algunos desafíos significativos para la traducción clínica de este enfoque.
Por esta razón, varios grupos han estado tratando de generar células similares a la CEC a partir de fuentes alternativas de células madre, como células madre, células derivadas de la piel, células estromales corneales y células PSC . En estos estudios se aplicó nuestra comprensión actual del desarrollo embrionario de los CEC aislando poblaciones progenitoras de CEC supuestas, como los CCN, de células primarias y diferenciándolas a células más maduras similares a la CEC. Por ejemplo, se aislaron y cultivaron células de estroma corneal y precursores derivados de la piel que contenían NCCs en presencia de ácido retinoico e inhibidor de GSK 3β (activador de la vía de señalización Wnt) para inducir células similares a la CEC. Estas células mostraron regulación ascendente de Pitx2, factor de transcripción clave para el desarrollo del segmento ocular anterior, así como regulación ascendente de los marcadores CEC Atp1a1 y Cdh2. Es importante destacar que las células exhibieron características funcionales de los CEC, como la función de bomba. Cuando las células se trasplantaron utilizando una lámina de colágeno como soporte, restauraron la visión en un modelo de queratopatía de conejo . Usando un enfoque similar, Shen et al. precursores derivados de la piel diferenciados mediante coculturación con B4G12, una línea de CEC humana inmortalizada. Dentro de la semana de diferenciación, las células exhibieron una expresión marcada de los marcadores típicos de CEC. El trasplante de estas células resultó en la recuperación exitosa del grosor y la transparencia corneales en modelos de distrofia endotelial corneal en conejos y monos .
Los CCN también se pueden generar in vitro a partir de PCS, ofreciendo una fuente ilimitada y ampliable de células para aplicación clínica. Zhang et al. se informó de la diferenciación de las ESC humanas a células precursoras mesenquimales perioculares (POMPs), un subtipo de CCN, mediante el cocultivo transwell con células estromales corneales humanas. Estas pompas inducidas se cultivaron en medios condicionados a partir de células epiteliales del cristalino, y la diferenciación se confirmó mediante pruebas de expresión génica de marcadores típicos de CEC como N-Cadherina, FoxC1 y PITX2. Para enriquecer las células similares a la CEC, las células se clasificaron y sembraron en una matriz corneal porcina descelularizada, seguida de un trasplante exitoso e inducción de reparación corneal en un modelo de distrofia corneal en conejo .
Para evitar el uso de material xenogénico de córneas descelularizadas, los enfoques recientes están empleando compuestos de moléculas pequeñas y factores de crecimiento libres de xenointegración para inducir el destino de las células de la CCA. Varios grupos, por ejemplo, han mostrado diferenciación de las ESP a los CCN tras la inhibición de la vía TGFß/SMAD . Estos CCN se cultivaron en medios que contenían PDGF-BB y Dkk2, lo que indujo a las células a adquirir el aspecto hexagonal y expresar marcadores moleculares de las células CEC . Es importante destacar que las células podrían depositar colágeno generando una DM generada in vitro y expresar componentes principales de la función de la bomba endotelial de la córnea, como Na+K+ATPasea1 . Aunque es prometedor, el aspecto funcional de estas células similares a CEC derivadas de PSC espera más investigación. Algunas preguntas críticas futuras incluyen la capacidad de estas células CEC derivadas de PSC para funcionar como una barrera con fugas y mantener el estado de deshidratación de la córnea, así como la exploración de su potencial terapéutico in vivo.