Resumen
Eufrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), es una planta medicinal utilizada tradicionalmente en Europa para el tratamiento de diversos trastornos de salud, especialmente como colirio para tratar dolencias oculares como conjuntivitis y blefaritis que pueden asociarse con infecciones bacterianas. Se ha informado previamente que algunas especies de Eufrasia contienen aceite esencial. Sin embargo, se desconoce la composición y la bioactividad del aceite de E. rostkoviana. Por lo tanto, en este estudio, investigamos la composición química y la actividad antimicrobiana del aceite esencial de eufrasia contra algunos organismos asociados con infecciones oculares: Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans. Análisis por GC-MS revelado que más de 70 constituyentes, con n-ácido hexadecanoico (18.47%) como el principal constituyente seguido por el timol (7.97%), ácido mirístico (4.71%), linalol (4.65%), y anetol (4.09%). El aceite esencial mostró un efecto antimicrobiano contra todos los organismos analizados, a excepción de P. aeruginosa. La mejor actividad se observó frente a todas las bacterias grampositivas analizadas con concentraciones inhibitorias mínimas de 512 µg / ml. Este es el primer informe sobre la composición química del aceite esencial de E. rostkoviana y su actividad antimicrobiana.
1. Introducción
Eufrasia, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), se ha utilizado en Europa durante siglos como medicina tradicional para el tratamiento de diversas enfermedades. Las decocciones e infusiones de partes aéreas con flores se utilizan contra la tos seca, la ronquera, el tratamiento sintomático del resfriado, el dolor de oídos y el dolor de cabeza, la fiebre del heno, las lesiones purulentas de la piel o las enfermedades catarrales del tracto intestinal, pero especialmente como colirio para tratar y prevenir trastornos oculares como conjuntivitis, blefaritis, fatiga ocular, inflamación ocular purulenta y orzuelos . El uso de té de eufrasia también se ha reportado en medicina etnoveterinaria para el tratamiento de infecciones de ojo de vaca . A pesar de siglos de uso tradicional para el tratamiento de dolencias oculares, solo se ha realizado un ensayo prospectivo de cohortes que confirma la eficacia de las gotas oftálmicas de Euphrasia en el tratamiento de la conjuntivitis y un único estudio clínico que investiga el efecto de la aplicación local de las gotas oftálmicas en el consumo de antibióticos en neonatos . Además, hasta los informes recientes sobre la actividad anticandidal y antibacteriana de algunos extractos de Eufrasia, el espectro de acción antimicrobiana era completamente desconocido.
El efecto terapéutico de E. rostkoviana se puede atribuir principalmente a su actividad antioxidante, antiinflamatoria y antimicrobiana . Entre los compuestos previamente identificados en los extractos de E. rostkoviana , la apigenina, la luteolina, el kaempferol, la quercetina, el ácido cafeico, el ácido cumárico y el ácido rosmarínico pueden ser responsables de la acción antimicrobiana. Aunque se ha informado previamente de la presencia de aceite esencial (EO) en E. officinalis L. y E. stricta Kunt, se desconoce la composición y la bioactividad del EO de E. rostkoviana. Por lo tanto, en este estudio, investigamos la composición química y la actividad antimicrobiana de la OE eufrasia contra el panel de tres bacterias Gram positivas (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus y S. epidermidis) y tres bacterias Gram negativas (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa) y una levadura (Candida albicans), organismos comúnmente asociados con infecciones oculares.
2. Material y métodos
2.1. Productos químicos y Material vegetal
Los estándares auténticos borneol, alcanfor, carvacrol, carvona, cariofileno, p-cimeno, estragol, eucaliptol, limoneno, linalol, mentol, mentona, β-mirceno, γ-terpineno y timol para la identificación de componentes de óxido de etileno, así como los antibióticos de control ciprofloxacina y tioconazol, se compraron a Sigma-Aldrich (Praga, República Checa). Se utilizaron como disolventes hexano (Merck, Praga, República Checa), dimetilsulfóxido (DMSO) (Lach-Ner, Neratovice, República Checa) y Tween 80 (Sigma-Aldrich, Praga, República Checa). El material vegetal utilizado para la destilación de EO se compró a fuentes comerciales (F-DENTAL, Hodonín, República Checa). El EO se extrajo por hidrodestilación utilizando un aparato tipo Clevenger.
2.2. Análisis Químico del EO mediante Cromatografía de Gases y Espectrometría de Masas (GC-MS)
El EO de E. rostkoviana se analizó mediante GC-MS utilizando Agilent 7890A GC acoplado a un detector de masa de un solo cuadrupolo Agilent 5975C equipado con una columna HP-5MS (película de 30 m × 0,25 mm, 0,25 µm) de Agilent (Santa Clara, CA, EE.UU.). Se utilizó hexano como disolvente y se inyectó el volumen de muestra de 1 µL en modo dividido (relación 20 : 1) en el inyector calentado a 250°C. La temperatura del horno de arranque se fijó en 60°C durante 3 min, se programó a 230°C a una velocidad de 3°C/min, y luego se mantuvo constante durante 10 min. Se utilizó helio como gas portador con un caudal de 1 mL/min. El análisis de MS se llevó a cabo en modo de escaneo completo y la energía de ionización de electrones se estableció en 70 eV. La identificación de componentes individuales se basó en la comparación de sus espectros de masa e índices de retención relativos con la Biblioteca y la literatura del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST, EE.UU.), así como en la coinyección de estándares auténticos.
2.3. Cepas Bacterianas y Medios de Cultivo
Las cepas estándar de tres bacterias Gram positivas Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213 y S. epidermidis ATCC 12228, tres bacterias gramnegativas Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, y una levadura Candida albicans ATCC 10231 se obtuvieron de Oxoid (Basingstoke, Reino Unido). El caldo Mueller-Hinton ajustado a cationes (MHB) y el caldo de dextrosa Sabouraud (SDB) se utilizaron como medios de cultivo para el ensayo de microdilución antibacteriana y antifúngica, respectivamente, y se equilibraron con solución salina tamponada Tris (Sigma-Aldrich, Praga, República Checa). Se utilizaron agar Mueller-Hinton (MHA) y agar dextrosa Sabouraud (SDA) para la determinación posterior de las concentraciones bactericidas y fungicidas, respectivamente. Todos los medios fueron comprados a Oxoid (Basingstoke, Reino Unido).
2.4. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
Las CMI se determinaron utilizando el método de microdilución de caldo in vitro siguiendo las directrices del Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (CLSI) modificadas de acuerdo con las recomendaciones propuestas para la evaluación efectiva del potencial antiinfeccioso de productos naturales utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos. Brevemente, el EO se disolvió en DMSO con adición de Tween 80 y se prepararon diluciones en serie de dos veces en MHB para bacterias y en SDB para la levadura, mientras que las concentraciones probadas oscilaron entre 4 y 2048 µg/ml. El inóculo se preparó a partir de cultivos nocturnos de manera que las concentraciones iniciales de UFC en las microplacas fueron de 5 × 105 y 2 × 103 UFC/ml para bacterias y levaduras, respectivamente. Las placas inoculadas se examinaron después de 24 h de incubación a 35°C y una vez más después de 48 h en el caso de C. albicans. El crecimiento microbiano se midió espectrofotométricamente mediante el Fotómetro de Microplacas Multiscan Ascent (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.) a 405 nm. Los MICs se expresaron como las concentraciones más bajas capaces de inhibir ≥ 80% del crecimiento bacteriano en comparación con el control positivo del crecimiento. Los experimentos se realizaron por triplicado en tres pruebas independientes y se utilizaron valores medios para el cálculo de la MICs. Debido a la posibilidad recientemente reportada de la influencia de componentes volátiles de óxido de etileno en el crecimiento microbiano en pozos adyacentes , se insertaron filas de control de crecimiento positivo entre las filas de dilución de óxido de etileno para detectar la eventual influencia del crecimiento. Los disolventes utilizados no inhibieron el crecimiento bacteriano en las concentraciones analizadas. Ciprofloxacino y tioconazol se utilizaron como antibióticos de referencia para bacterias y levaduras, respectivamente.
2.5. Determinación de Concentración Bactericida Mínima (CMM) y Concentración Fungicida Mínima(CMF)
Las alícuotas de 20 µL se transfirieron de cada pocillo sin crecimiento microbiano a las placas MHA (placas SDA para C. albicans) después de 24 h y 48 h de incubación de bacterias y levaduras analizadas, respectivamente. Las placas se incubaron durante 24 h a 35°C. El CMM y el CMF se evaluaron como una disminución ≥99,9% de UFC en comparación con el inóculo, todo realizado por triplicado en tres pruebas independientes.
3. Resultados y Discusión
3.1. Caracterización química de Aceites y Componentes de Fracciones Bioactivas
La hidrodestilación de EO por aparato tipo Clevenger produjo un 0,02% (p/v) de aceite marrón amarillento que tiende a solidificarse a temperatura ambiente, lo que probablemente es causado por una alta proporción de ácidos grasos (32,23% en total). Análisis por GC-MS de la EO reveló la presencia de más de 70 de los mandantes, con el ácido palmítico (18.47%), siendo el componente más abundante seguido por el timol (7.97%), ácido mirístico (4.71%), linalol (4.65%), anetol (4.09%), linolénico (3.81%), hexahydrofarnesyl acetona (3.16%), ácido láurico (2.79%), α-terpineol (2.39%), and borneol (2.39%). The main compounds are shown also in the chromatogram (Figure 1) and the complete list of EO constituents is presented in Table 1.
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| R: retention indices relative to n-alkanes on HP-5MS capillary column (30 m × 0.25 mm, 0.25 m); peak area relative to total peak area in %; ID: identification method; a: identification based on mass spectra matching; b: identification based on retention index; c: identificación basada en la coinyección de la muestra auténtica; d: identificación tentativa. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
El alto contenido de ácidos grasos se ha encontrado previamente en el E. stricta EO (25,7% en total) también con la mayor proporción de ácido palmítico (20,3%) y ácido mirístico (3,9%). Sin embargo, no hay ningún otro compuesto presente en una cantidad significativa que indique la relación de estas dos especies de Eufrasia.
3.2. Actividad antimicrobiana
La E. la EO de rostkoviana mostró actividad contra seis de los siete organismos analizados con MICs que oscilaban entre 512 y 2048 µg / mL. Las bacterias Gram positivas fueron más sensibles que las Gram negativas y la levadura, mientras que P. aeruginosa fue el único organismo que no fue inhibido por el aceite en las concentraciones más altas analizadas. En el cuadro 2 se resumen las encuestas de indicadores múltiples, los CMMB y los CMF del EO en comparación con todos los microorganismos probados. Las concentraciones activas son comparables a las reportadas anteriormente para, por ejemplo, EOs de Artemisia annua, Eucalyptus globulus, Mentha suaveolens, Myrtus communis, Ocimum basilicum o Thymus vulgaris, especialmente en el caso de actividad anticandidal . El aceite también fue más efectivo que los extractos de E. rostkoviana probados por Teixeira y Silva contra E. coli, E. faecalis, S. aureus y S. epidermidis. Los MICs de los antibióticos de referencia contra las bacterias y levaduras susceptibles a la E. las EO de rostkoviana se ajustaban a los límites aceptables de la CLSI y a los informes anteriores, respectivamente .
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| The growth inhibition was measured after 24 h and 48 h of incubation in case of C. albicans; EO: essential oil; CIP: ciprofloxacin; TIO: tioconazole; MIC: minimum inhibitory concentration; IC50: inhibitory concentration causing ≥50% of bacterial growth; MBC: minimum bactericidal concentration; MFC: minimum fungicidal concentration. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Dado que el contenido del principal componente de EO ácido palmítico no supera el 20% y hay más de 10 otros compuestos activos antimicrobianos que van del 1 al 8%, es difícil sugerir los principales agentes responsables del efecto antimicrobiano de E. rostkoviana EO. El ácido palmítico ha sido identificado previamente como el compuesto principal de fracciones activas contra bacterias Gram negativas, pero no Gram positivas . Por otro lado, se sabe que los ácidos grasos saturados de cadena media y los ácidos grasos insaturados de cadena larga inhiben especialmente las bacterias grampositivas . Además, el ácido láurico ejerce también actividad contra una serie de hongos . Por lo tanto, la actividad antimicrobiana del EO se debe probablemente a una acción compleja de los ácidos grasos antimicrobianos con los otros compuestos antimicrobianos conocidos identificados en el EO, como el anetol, el borneol, el alcanfor, el carvacrol, el linalol, el mentol, el α-terpineol o el timol.
4. Conclusiones
En conclusión, el análisis químico reveló una serie de sustancias antimicrobianas activas presentes en la E. se confirmó la EO rostkoviana y su actividad antifúngica y antibacteriana contra bacterias Gram positivas y Gram negativas. Hasta donde sabemos, este es el primer informe sobre la composición y la actividad antimicrobiana de E. rostkoviana EO.
Conflicto de Intereses
Los autores declaran que no existe conflicto de intereses con respecto a la publicación de este documento.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Fundación Europea de la Ciencia y el Proyecto CZ del Ministerio de Educación, Juventud y Deportes de la República Checa.1.07/2.3.00/30.0040; por la beca S del Ministerio de Educación, Juventud y Deportes de la República Checa; y por el Proyecto IGA 20155012 de la Universidad Checa de Ciencias de la Vida de Praga. Los autores agradecen a Slavka Barlakova la corrección de textos en inglés.