Expedition nach Südamerika
In Humboldt war die Überzeugung gewachsen, dass sein eigentliches Lebensziel die wissenschaftliche Erforschung war, und 1797 trat er von seinem Posten zurück, um sich mit großer Zielstrebigkeit ein gründliches Wissen über die Systeme der geodätischen, meteorologischen und geomagnetischen Messungen anzueignen. Die politischen Umwälzungen durch die Napoleonischen Kriege verhinderten die Durchführung mehrerer wissenschaftlicher Expeditionen, an denen Humboldt teilnehmen konnte. Endlich, entmutigt von seinen Enttäuschungen, weigerte er sich jedoch, von seinem Vorhaben abgeschreckt zu werden, und erhielt von der spanischen Regierung die Erlaubnis, die spanischen Kolonien in Mittel- und Südamerika zu besuchen. Diese Kolonien waren dann nur für spanische Beamte und die römisch-katholische Mission zugänglich. Völlig abgeschottet von der Außenwelt boten sie einem wissenschaftlichen Entdecker enorme Möglichkeiten. Humboldts soziale Stellung sicherte ihm den Zugang zu offiziellen Kreisen, und im spanischen Premierminister Mariano de Urquijo fand er einen aufgeklärten Mann, der seinen Antrag auf eine königliche Genehmigung beim König unterstützte. Im Sommer 1799 segelte er von Marseille aus in Begleitung des französischen Botanikers Aimé Bonpland, den er in Paris, dem damals lebhaftesten wissenschaftlichen Zentrum Europas, kennengelernt hatte. Der Nachlass, den er nach dem Tod seiner Mutter geerbt hatte, ermöglichte es Humboldt, die Expedition vollständig aus eigener Tasche zu finanzieren. Humboldt und Bonpland verbrachten fünf Jahre, von 1799 bis 1804, in Mittel- und Südamerika und legten mehr als 6.000 Meilen (9.650 km) zu Fuß, zu Pferd und in Kanus zurück. Es war ein Leben großer körperlicher Anstrengung und schwerer Entbehrung.
Von Caracas aus reisten sie durch Grasland und Buschland nach Süden, bis sie die Ufer des Apure erreichten, eines Nebenflusses des Orinoco. Sie setzten ihre Reise auf dem Fluss mit dem Kanu bis zum Orinoco fort. Nach seinem Verlauf und dem des Casiquiare bewiesen sie, dass der Casiquiare eine Verbindung zwischen den riesigen Flusssystemen des Amazonas und des Orinoco herstellte. Drei Monate lang zogen Humboldt und Bonpland durch dichte Tropenwälder, gequält von Moskitowolken und erstickt von der feuchten Hitze. Ihre Vorräte wurden bald durch Insekten und Regen zerstört; Der Mangel an Nahrung trieb sie schließlich dazu, sich von gemahlenen wilden Kakaobohnen und Flusswasser zu ernähren. Doch beide Reisenden, die von der Aufregung der neuen und überwältigenden Eindrücke beflügelt wurden, blieben gesund und in bester Stimmung, bis sie in die Zivilisation zurückkehrten, als sie einem schweren Fieberanfall erlagen.Nach einem kurzen Aufenthalt in Kuba kehrten Humboldt und Bonpland nach Südamerika zurück, um die Anden ausgiebig zu erkunden. Von Bogotá nach Trujillo, Peru, wanderten sie über das Andenhochland – auf einer Route, die heute von der Panamericana durchquert wird, zu ihrer Zeit eine Reihe steiler, felsiger und oft sehr schmaler Wege. Sie bestiegen eine Reihe von Gipfeln, darunter alle Vulkane in der Umgebung von Quito, Ecuador; Humboldts Aufstieg von Chimborazo (20.702 Fuß) auf eine Höhe von 19.286 Fuß (5.878 Meter), aber kurz vor dem Gipfel, blieb fast 30 Jahre lang ein Weltrekord beim Bergsteigen. Alle diese Errungenschaften wurden ohne die Hilfe moderner Bergsteigerausrüstung, ohne Seile, Steigeisen oder Sauerstoffversorgung durchgeführt; Humboldt und Bonpland litten daher schwer unter der Bergkrankheit. Aber Humboldt wandte sein Unbehagen zum Vorteil: er war der erste, der die Bergkrankheit dem Sauerstoffmangel in der verdünnten Luft großer Höhen zuschrieb. Er studierte auch die ozeanische Strömung vor der Westküste Südamerikas, die ursprünglich nach ihm benannt wurde, heute aber als Peru-Strömung bekannt ist. Als das Paar in Quito ankam, hatte Humboldt, der erfahrene Bergsteiger und unermüdliche Sammler wissenschaftlicher Daten, keine Schwierigkeiten, die Rolle des Höflings und Mannes der Welt zu übernehmen, als er vom Vizekönig und den Führern der spanischen Gesellschaft empfangen wurde.
Im Frühjahr 1803 segelten die beiden Reisenden von Guayaquil nach Acapulco, Mexiko, wo sie das letzte Jahr ihrer Expedition verbrachten, um diesen am weitesten entwickelten und hochzivilisierten Teil der spanischen Kolonien genau zu studieren. Nach einem kurzen Aufenthalt in den USA, wo Humboldt von US-Pres. Thomas Jefferson, sie segelten nach Frankreich.
Humboldt und Bonpland kehrten mit einer immensen Menge an Informationen zurück. Neben einer umfangreichen Sammlung neuer Pflanzen gab es Längen- und Breitenbestimmungen, Messungen der Komponenten des Erdmagnetfelds der Erde und tägliche Beobachtungen von Temperaturen und Luftdruck sowie statistische Daten zu den sozialen und wirtschaftlichen Bedingungen Mexikos. Wann immer Humboldt sich in einem Handelszentrum in Amerika befunden hatte, Er hatte Berichte und Duplikate seiner Sammlungen an seinen Bruder geschickt, Wilhelm, der ein bekannter Philologe geworden war, und an französische Wissenschaftler; leider verhinderte die damals von britischen Schiffen erzwungene Kontinentalblockade, dass der größte Teil seiner Post sein Ziel erreichte.