Fünf Pax-6-Varianten und ihre Expressionsmuster in Tintenfischembryonen und adulten Augengeweben
Wir führten eine einzelne 3′-RACE-PCR für das Pax-6-Gen des Zwergkalmars (bezeichnet als IpPax-6) durch, um die Spleißvarianten und mehrere Loci von Pax-6 6 bei koleoiden Kopffüßern. Wir fanden heraus, dass es im Pygmäenkalmar keine mehreren Loci gab, aber wir identifizierten drei Pax-6-Varianten mit diskreten Längen. Unterschiede in den Aminosäuresequenzen zwischen diesen Pax-6-Varianten waren auf begrenzte Regionen beschränkt. Daher wurde angenommen, dass sie das Ergebnis alternativer Spleißereignisse eines einzelnen Ortes sind. Als nächstes validierten wir das Vorhandensein von Spleißvarianten mittels RT-PCR und erhielten schließlich fünf Arten von Spleißvarianten, darunter ein scheinbares Ortholog von authentischem Pax-6 (Abbildung 1). Die Länge und Struktur des authentischen IpPax-6 ähnelten denen der Pax-6-Gene, die in anderen Tintenfischarten, Euprymna scolopes und Loligo pealei, gefunden wurden15,16. Authentisches IpPax-6 (authentische Form, 499 aa) umfasst zwei unabhängige DNA-bindende Domänen, die PD- und HD-Domänen und eine C-terminale P / S / T-reiche Domäne (PST), die der dedizierte Aktivator mit einem Partnertransaktivatorprotein ist, wie in vielen Tieren gezeigt (Abbildung 1). Sowohl die Ähnlichkeit der Proteinsequenz als auch der phylogenetische Baum bestätigten, dass IpPax-6 ein Ortholog von Fly ey und vertebrate Pax-4/6 war (Ergänzende Abbildung 1). Die vier identifizierten Varianten produzierten Proteine mit Längen, die sich von denen von authentischem IpPax-6 unterschieden (Abbildung 1).
Diagramme von Spleißvarianten im Pygmäenkalmar.
Die obere Zeile zeigt eine geschätzte Exon-Intron-Struktur des Squid-Pax-6-Gens. Die Pfeilspitze zeigt ein Intron, das in Tintenfischarten durch genomische PCR-Analyse und in einer früheren Studie bestätigt wurde. Die authentische Form (499 aa) ist die häufigste und ähnelt dem Pax-6-Gen anderer Tintenfischarten. Varianten 1 und 3 fehlt das Exon 4-Codierung der N-terminalen Hälfte der HD. Varianten 2 und 3 haben ein zusätzliches Exon, Exon 6, in der PST-Domäne. Variante 4 zeigt auch ein zusätzliches Exon 3, das 20 Aminosäuren in der Linkerregion zwischen den PD- und HD-Domänen kodiert.
Um die stadiumsspezifische Expression der Squid-Pax-6-Varianten zu untersuchen, führten wir Q-PCR für verschiedene Gewebe und in verschiedenen Embryonalstadien mit Primern durch, die auf die zusätzlichen Exons von IpPax-6 abzielen (Abbildung 2 & Abbildung S2). Tintenfischeier zeigen epibolische Gastrulation und direkte Entwicklung ohne typische molluskische Larvenstadien17. Embryonale Augen erscheinen aus dem äußeren Epiderm der Blastoscheibe und sind nach Stadium 18 differenzierbar, wobei die Netzhautpigmentierung im Stadium 20 beginnt. Die Linse erscheint als transparente stabartige Struktur, die mit bloßem Auge im Stadium 25 sichtbar ist. Wir führten zunächst eine Q-PCR unter Verwendung von Primern durch, die auf Exon 2 abzielen und alle fünf Varianten abdecken. Die Q-PCR-Analyse zeigte, dass IpPax-6 im Stadium 16 vor der Augenvesikelbildung exprimiert wurde (Abbildung 2A). Die Expressionsintensität von IpPax-6 wurde mit der Entwicklung des Tintenfischembryos allmählich hochreguliert (Abbildung 2A), wobei der Augapfel die höchsten Expressionsintensitäten unter den getesteten Geweben zeigte. Wie bei den anderen bilateralen Tieren beobachtet, wurden die authentischen und varianten Formen von IpPax-6 in deutlich verminderten Konzentrationen im Muskelgewebe exprimiert. Wir verwendeten dann Primer, die auf Varianten abzielten, denen Exon 4 fehlte (Varianten 1 und 3, Abbildung 2B). Die Primer detektierten die Varianten 1 und 3 in niedrigen Konzentrationen in den Embryonen im Stadium 16 und im Augapfelgewebe. Wir verwendeten auch Primer, die auf Varianten einschließlich Exon 6 abzielten (Varianten 2 und 3, Abbildung 2C). Die Q-PCR-Analyse zeigte, dass die Varianten 2 und 3 in den Augäpfeln und Sehlappen sowie in Embryonen in den Stadien 16 und 25 exprimiert wurden. Da die Bildung von Photorezeptorzellen und der Linse in Embryonen im Stadium 25 beginnt, können die Varianten einschließlich Exon 6 zur Augenentwicklung beitragen. Die Ergebnisse zeigen, dass sich die Expressionsmuster der IpPax-6-Varianten signifikant von denen des authentischen IpPax-6 unterschieden.
Expression des Zwergkalmars Pax-6 Varianten.
Die Expressionsniveaus aller IpPax-6-Varianten (A), Varianten ohne Exon 4 (Varianten 1 und 3) (B) und Varianten mit Exon 6 (Varianten 2 und 3) (C) wurden durch Echtzeit-RT-PCR-Analyse quantifiziert. Das Expressionsniveau in jedem Körperteil relativ zu stage16 (1.0) wurde berechnet und anschließend auf das Expressionsniveau von Alpha-Tubulin normalisiert. Die Quantifizierungen wurden zweimal an verschiedenen cDNAs durchgeführt, die unabhängig voneinander erzeugt wurden, und geometrische Mittel wurden berechnet. Die y-Achse ist beliebig. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar. (D–G) Whole-Mount in situ Hybridisierungsanalysen mit Anti-Sense RNA Sonden für IpPax-6 Exon 2 (D, F) und IpPax-6 Exon 4 (E, G). Eine aus Exon 2 entworfene RNA-Sonde, die auf alle fünf Varianten abzielte, zeigte die Pax-6-Expression im Gehirnbereich von Embryonen im Stadium 22 (D) und im Stadium 25 (F). Die aus Exon 2 entworfene RNA-Sonde zeigt auch die Pax-6-Expression um die Augen an (D‘, Seitenansicht). Eine aus Exon 4 entworfene RNA-Sonde, die intrinsisch auf Varianten abzielt, sowie die Variantenformen 2 und 4 zeigten ähnliche Expressionsmuster (E, G) wie die Sonde, die auf Exon 2 abzielt, außer im Gewebe um die Augen (E). Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Varianten mit einer Exon-4-Deletion (Varianten 1 und 3) im Vergleich zu den anderen Varianten (Pfeilspitze) eine spezifische Lokalisation im Gewebe um die Augen zeigen. Maßstabsbalken, 10 µm.
Um zu unterscheiden, welche Varianten in jeder Stufe vorhanden sind, führten wir RT-PCR unter Verwendung von Primersätzen über Exongrenzen hinweg durch. Es wurde angenommen, dass Variante 1 in allen / einigen embryonalen Stadien exprimiert wird, jedoch nicht in den erwachsenen Augen (Ergänzende Abbildung 2). Die RT-PCR-Analyse zeigte auch, dass Variante 4 in den erwachsenen Augen, insbesondere in der Netzhaut, stark exprimiert wurde, jedoch nicht in den Linsen (Ergänzende Abbildung 2A). Die Varianten 2 und 3 wurden in allen Embryonalstadien und auch in adulten Geweben exprimiert (Ergänzende Abbildung 2B).
Um die gewebespezifische Expression von IpPax-6-Varianten zu identifizieren, führten wir eine In–situ-Hybridisierung mit RNA-Sonden durch, die spezifisch an jede Variante binden (Abbildung 2D-G). Die aus Exon 2 entwickelte RNA-Sonde zielt auf alle fünf in dieser Studie identifizierten Varianten ab. Die RNA-Sonde ist vom Exon 4 an die authentische Form und an die Varianten 2 und 4 gebunden. Es wurde festgestellt, dass IpPax-6 im Gehirnbereich lokalisiert ist, einschließlich des dorsalen Basallappens, des oberen Frontallappens, des Stiel– / Riechlappens und des Optikuslappens (Abbildung 2D-G), wie in Hartmann et al.18 Das Gewebe außerhalb der Netzhaut (möglicherweise entsprechend der zukünftigen Iridophorschicht) exprimierte ebenfalls deutlich IpPax-6 im Stadium 22 (Abbildungen 2D und 2D‘). Die IpPax-6-Expression wurde in dieser Schicht bis zum Stadium 25 beobachtet. Die In-situ-Hybridisierung unter Verwendung der Sonde, die auf Exon 4 abzielt, deutete darauf hin, dass die Varianten 2 und 4 ähnliche Expressionsmuster im Gehirn, aber nicht in den Augen aufwiesen (Abbildung 2E). Dieser Befund legt nahe, dass die Varianten 1 und 3 (ohne Exon 4) in der äußeren Augenschicht hochreguliert sind. Diese Konsequenzen implizieren, dass jede IpPax-6-Variante unabhängig von den Prozessen der Augenbildung reguliert wird.
Exon-Intron-Struktur von Pax-6 in anderen Kopffüßern/Weichtieren
Wir untersuchten, ob diese Art des alternativen Spleißens nur bei koleoiden Kopffüßern erworben wurde. Anwendung der RT-PCR-Analyse auf japanische Spear Squid (Loligo bleekeri) embryonale RNAs, Wir fanden drei Arten von mRNAs, die möglicherweise aus alternativem Spleißen stammen (Exon 4 Überspringen, Exon 3 Insertion und Exon 6 Insertion) in den Augen (Abbildung 3A, B). Die eingefügten Exons 3 und 6 kodierten jeweils 20 und 40 Aminosäuren, während das übersprungene Exon 4 51 Aminosäuren kodierte. Um das Vorhandensein eines ähnlichen alternativen Spleißens in anderen Molluskengenomen zu untersuchen, untersuchten wir die Exon-Intron-Strukturen von Pax-6 in der Eulenschnecke und der Perlmuschel. Die vollständige Genomsequenz der Eulenschnecke (Lottia gigantea, erhalten von JGI genome portal Lotgi v1.0, e_gw1.86.103.1)19 und der Perlauster (Pinctada fucata, erhalten von der OIST Marine Genomics Unit genome browser P. fucata_ver1.0, Transkript: pfu_aug1.0_8418.1_67856.t1, gerüst8418.1) 20 zeigte, dass Molluscan Pax-6 fünf Exons hat. Exon 4 im Tintenfisch wurde über die getesteten Weichtierarten konserviert. Die Exons 3 und 5 wurden jedoch nicht im Pearl Oyster Pax-6-Gen gefunden. So fanden wir heraus, dass die Variantenformen 2 und 4 in der Coleoid-Kopffüßer-Linie erworben wurden (Abbildung 1).
Indels in IpPax-6-Varianten und vorhergesagte 3D-Strukturen der HD.
Ausgerichtete Nukleotidsequenzen von (A) Exon 3 und (B) Exon 6 des Pygmäenkalmars bzw. des japanischen Speerkalmars. Alignment von translatierten Aminosäuresequenzen der in der vergleichenden Modellierung verwendeten Proteine (C). Den Varianten 1 und 3 von IpPax-6 fehlt ein Teil von Helix 1. Die dreidimensionale Struktur des gespleißten HD wird durch Homologiemodellierung erhalten (D, D‘). Grüne Stäbchen zeigen Proteine von IpPax-6 an und graue Kugeln repräsentieren Ziel-DNA-Moleküle. Der gestrichelte Kreis zeigt den Teil der Helix 1, der durch die Deletion von Exon 4 verloren gegangen ist.
Nach unserem besten Wissen ist unsere Studie die erste, die In-Frame-Spleißvarianten von Squid Pax-6 berichtet, die je nach embryonalem Stadium unterschiedlich exprimiert wurden. Frühere Studien isolierten diskrete Arten von Spleißvarianten, die die N-terminale Hälfte der PD-Domäne in anderen Squid-Arten verloren haben15,18, aber diese Varianten zeigten keine räumlich-zeitlichen Unterschiede in der Expression. Unsere Studie schlug auch vor, dass die Mechanismen, die dem Erwerb von Variationen in Pax-6-Transkripten durch alternatives Spleißen zugrunde liegen, einzigartig in der Coleoid-Kopffüßer-Linie erworben wurden, da die unteren Weichtiere, wie Muscheln, kein entsprechendes exon-ähnliches Fragment in ihrem Genom besitzen.
Funktion der Pax-6-Varianten und ihre mutmaßliche Rolle bei der Augenentwicklung
Es wird erwartet, dass die Addition und Deletion eines Aminosäurenfragments, das in den alternativ verwendeten Exons kodiert ist, strukturelle Veränderungen in den IpPax-6-Proteinvarianten verursacht, die ihre Funktion im Entwicklungsprozess verändern können. Zwei seiner Varianten (Varianten 1 und 3) fehlt ein 153mer in der Mitte des Pax-6 und die Hälfte der HD (Abbildung 1). Um zu untersuchen, ob die Deletion ihre funktionellen Eigenschaften beeinflusst, haben wir dreidimensionale (3D) Strukturvorhersagen der Proteine basierend auf vergleichender Modellierung durchgeführt. Die mutmaßlichen 3D-Strukturen des HDs von authentischem IpPax-6 und der Variante ohne das von Exon 3 codierte Segment wurden konstruiert. Die Template-Struktur wurde durch DNA-gebundene Form identifiziert, so dass wir die Struktur von IpPax-6 und die Variante in DNA-gebundener Form vorhersagen konnten. Die vermeintliche 3D-Struktur der authentischen Form wurde einigermaßen gut modelliert; die Kernreste, nämlich Phe auf der Schleife vor der ersten Helix der HD, Leu auf der ersten Helix, Leu auf der zweiten Helix und Trp und Phe auf der dritten Helix der Modellstruktur, wurden konserviert und die drei Helices der HD waren anscheinend dicht ineinander gepackt (Abbildung 3C). Die für die DNA-Bindung wichtigen Reste, nämlich zwei Arg-Reste am N-terminalen Arm und polare Reste auf der Oberfläche der dritten Helix, befanden sich relativ nahe an der DNA-Grenzfläche (Abbildung 3C, D). Die vermeintliche 3D-Struktur der Variante stellte jedoch eine Reihe problematischer Probleme dar. In der modellierten Struktur wurde der Verlust der von Exon 3 codierten Region, die den N-terminalen Teil der ersten Helix codiert, durch 15 in Exon 2 codierte Reste kompensiert. Somit unterschieden sich die Aminosäuresequenzen der authentischen und der varianten Formen nur in dem Bereich, der die 15 Reste der N-terminalen Seite enthielt. Dieser Unterschied erhöhte jedoch die strukturelle Energie der Variante signifikant und destabilisierte anscheinend die Gesamtstruktur. Diese Instabilität kann aus einem Fehlen des Phe auf der Schleife vor der ersten Helix und des Leu auf der ersten Helix resultieren. Diese Komponenten sind offensichtlich wichtig für die Verpackung der drei Helices. Außerdem fehlten in der Variante zwei Arg-Reste an der N-terminalen Schleife, die an die DNA-Basen in der Nebenrille in der authentischen Form binden. Diese Probleme in der Stabilität und DNA-Bindung in der Variante deuten stark darauf hin, dass die Domäne der Variante instabil ist und dass die Domäne wenig Bindungsaffinität für DNA hat (Abbildungen 3D und 3D‘). Das Fehlen einer stabilen Huntington-Krankheit legt ferner nahe, dass die Varianten 1 und 3 unterschiedliche DNA-Zielstellen aufweisen als die von authentischem IpPax-6 bei Tintenfischarten.
Zwei Varianten (Varianten 2 und 3) zeigten ebenfalls eine 120-mer-Einfügung innerhalb der PST-Domäne (Abbildung 1). Die eingefügte Sequenz erwies sich als spezifisch für Squid (Abbildung 2). Diese Einfügung kann die Transaktivierungsaktivitäten der PST-Domäne ändern. Variante 4 zeigte eine einzigartige Insertion (57 mer) zwischen PD und HD. Das Motif-Programm (http://www.genome.jp/tools/motif/) fand keine bekannten Domänen oder Signaturen in der eingefügten Sequenz. Diese Insertion verlängert einen Linker zwischen den PD- und HD-Domänen.