HPV / p16-positive und negative HNSCC zeigen Unterschiede in der Knotenbeteiligung
Wir haben den HPV- und p16-Status von 241 Patienten mit oropharyngealem Plattenepithelkarzinom (OPC) bestimmt, die mit (Chemo-) Bestrahlung (c) RT behandelt wurden. Die menschlichen Tumorproben wurden gemäß den vom Ethikrat der Universitätskliniken Leuven (Leuven, Belgien) genehmigten Protokollen entnommen und die stillschweigende Zustimmung aller Patienten eingeholt. Klinisch-pathologische Daten wurden aus Patientendiagrammen extrahiert und die mittlere Nachbeobachtungszeit betrug 4,19 Jahre. HPV-positive Patienten waren durch niedrigere T-Stadien gekennzeichnet, wobei 45% (26 von 58; p = 0,025) der HPV-positiven Patienten Tumore im T1 / 2-Stadium zeigten, während dies 29% (51 von 175; p = 0,025) in der HPV-negativen Gruppe waren. Darüber hinaus zeigten HPV-positive Tumoren signifikant höhere (p = 0.014) Knotenbeteiligung bei 72% (42 von 58) der HPV-positiven Patienten mit N2 / N3-Tumoren, während dies in der HPV-negativen Gruppe nur 54% (95 von 175) waren. Obwohl die Beziehung zwischen dem p16-Status und dem N-Stadium nicht signifikant war, wurde ein Trend zu einer höheren Knotenbeteiligung und p16-Positivität beobachtet. Dreiundsechzig% der p16-positiven Patienten zeigten N2 / N3-Tumoren, während dies in der p16-negativen Gruppe nur 54% waren (Tabelle 1). Diese Ergebnisse stimmen mit anderen Studien überein und zeigen, dass HPV-positive HNSCC-Patienten höhere N- und niedrigere T-Stadien aufweisen .
Wie erwartet führten niedrige T-Stadien zu besseren DC-Raten (Distant Control) mit 5-Jahres-Kontrollraten von 83% und 70% (p = 0,04) für T1/T2 und T3 /4 Tumoren (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S1A). N2 / 3-Tumoren (5-Jahres-DC 70%; p = 0,02) zeigten ein höheres Risiko für Herzinsuffizienz im Vergleich zu N0 / 1-Tumoren (5-Jahres-DC-Rate 85%; p = 0,02) (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S1B). Es wurde kein statistisch signifikanter Unterschied in der DC-Rate zwischen HPV-positiver und negativer Erkrankung beobachtet (5-Jahres-DC-Rate von 82% gegenüber 5-Jahres-DC-Rate von 72%; p = 0,20) (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S1C). Obwohl nicht signifikant, deutet dieser Unterschied von 10% in den DC-Raten auf einen Einfluss des Virus über die lokale Tumorkontrolle hinaus hin. Darüber hinaus zeigt es das Vorhandensein unterschiedlicher Verbreitungsmuster zwischen HPV-positivem und negativem HNSCC an.
p16 unterdrückt die Invasions- und Migrationskapazität von HPV-positivem HNSCC
Um den molekularen Mechanismus hinter diesen potenziellen Unterschieden bei der Metastasierung in unserer Patientenkohorte zu untersuchen, untersuchten wir die in vitro Migrations- und Invasionskapazität von HNSCC-Zellen. HPV/p16-positive SCC154- und SCC104-Zellen zeigten eine signifikant geringere Migrationsrate im Vergleich zu HPV/p16-negativen SQD9-, CAL27- und SC263-Zellen (Abb. 1a). In Übereinstimmung mit dem Migrationstest zeigten HPV/p16-positive Zellen im Vergleich zu den HPV/p16-negativen Zellen reduzierte Invasionsfähigkeiten (Abb. 1b).
p16 represses the in vitro invasion and migration capacity of HPV positive HNSCC. a Migration capacity of HPV negative cells (SQD9, CAL27 and SC263) and HPV positive cells (SCC154, SCC104). b Invasion capacity of HPV negative SQD9 cells and HPV positive SCC154 cells. c Migration capacity of HPV positive SCC154 cells treated with shRNA for p16 (shp16) and control (shluc). d Invasionskapazität von HPV-positiven SCC154-Zellen, die mit shRNA für p16 (shp16) und Kontrolle (shluc) behandelt wurden. (a-d) Das Ergebnis wird als Mittelwert ± SEM von drei Experimenten angezeigt und p-Werte werden durch zweiseitigen t-Test berechnet
Der Tumorsuppressor p16 ist ein bekannter Zellzyklusregulator und ein guter Ersatzmarker für HPV-positives HNSCC . Darüber hinaus schreiben neuere Daten p16 eine breitere Rolle zu, einschließlich einer Rolle bei der Migration und Unterdrückung der Angiogenese . Daher untersuchten wir auch den Einfluss von p16 auf die Migrations- und Invasionskapazität von HPV-positiven SCC154-Zellen, die mit Short Hairpin RNA (shRNA) für p16 (shp16) und Kontroll-shRNA (shluc) manipuliert wurden. Die Herunterregulierung der p16-Expression erhöhte die Migrations- und Invasionskapazitäten der SCC154-Zellen (Abb. 1c und d). Diese Daten bestätigen das Vorhandensein von Unterschieden in den Verbreitungsmustern zwischen HPV-positivem und negativem HNSCC und deuten auf eine aktive Rolle von p16 in der metastatischen Kaskade hin.
p16 unterdrückt Migration und Invasion durch Angiogenese bei HPV-positivem HNSCC
Es ist bekannt, dass die Angiogenese, die in Krebszellen durch pro-angiogene Faktoren wie den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor A (VEGFA) aktiv unterstützt wird, ein Kanal für die Ausbreitung und Metastasierung von Krebszellen ist und eine aggressive Tumorprogression fördert . Darüber hinaus ist die negative Korrelation zwischen HPV / p16 und VEGFA zuvor in HNSCC beschrieben . Daher untersuchten wir die Beziehung zwischen HPV, p16 und VEGFA in unserer Patientenkohorte. HPV-positive Patienten zeigten eine signifikant niedrigere VEGFA-Expression, wobei 54% (28 von 51) der Patienten keine oder eine niedrige VEGFA-Expression zeigten, verglichen mit 32% (53 von 161) in der HPV-negativen Gruppe (Tabelle 2). Obwohl die negative Korrelation zwischen VEGFA und p16 weniger ausgeprägt war, zeigte sich ein Trend zur Signifikanz (Tabelle 2).
Wir untersuchten weiter die Beziehung zwischen Angiogenese und p16 mit in vivo Xenotransplantaten, die mit SCC154-HPV-positiven Zellen injiziert wurden, die mit shp16 oder shluc manipuliert wurden. Eine höhere Anzahl von Blutgefäßen wurde bei Mäusetumoren mit niedriger p16-Expression im Vergleich zu Kontrolltumoren nachgewiesen (Abb. 2a). Darüber hinaus führte die Zunahme der Vaskularisierung zu einer geringeren Nekrose, einer höheren Anzahl mitotischer Zellen und einem Wachstumsvorteil von shp16-exprimierenden Tumoren (Zusätzliche Datei 2: Abbildung S2A-C). Wir konnten die Beteiligung von p16 an der Unterdrückung von Metastasen in vivo aufgrund des Fehlens eines metastasierten Tiermodells nicht verifizieren. Der Wachstumsvorteil und die erhöhte Vaskularisation bei shp16-Mäusetumoren können jedoch das häufige Auftreten fortgeschrittener T-Stadien bei HPV-negativen HNSCC-Patienten erklären.
Doppelrolle von p16 bei der Verbreitung von HNSCC. Eine Blutgefäßbildung in SCC154 shp16- und SCC154 shluc Xenograft-Mausmodellen, bewertet durch CD31-Färbung (über der Grafik); n = 5. b Durchschnittliche Anzahl der Lymphgefäßbildung in SCC154 shp16- und SCC154 shluc-Xenotransplantat-Mausmodellen, bewertet durch LYVE-1-Färbung (über der Grafik); n = 5. c Durchschnittliche Punktzahl der alpha4 beta1 integrin Färbung in SCC154 shp16 und SCC154 shluc Maus xenograft Modelle; n = 5. d Average score of alpha4 beta1 integrin staining in HPV positive SCC154 (n = 7) and HPV negative SQD9 (n = 10) mouse xenograft models. a-d P-Werte werden durch zweiseitigen T-Test berechnet
p16 stimuliert die Lymphangiogenese und die Knotenausbreitung bei HPV-positivem HNSCC
Diese Ergebnisse erklären immer noch nicht das Auftreten ähnlicher entfernter Rückfallraten bei HPV / p16-positiven und negativen HNSCC-Patienten und erklären sicherlich nicht den hochsignifikanten Zusammenhang zwischen HPV-Positivität und knotenbeteiligung, die in unserer und mehreren anderen Studien beschrieben wurde . Dies ist besonders wichtig, da es das Vorhandensein eines hohen lokalen Metastasierungspotentials bei HPV-positivem HNSCC impliziert. Interessanterweise fördert die Lymphangiogenese wie die Angiogenese die Tumormetastasierung, indem sie das Wachstum neuer Lymphgefäße innerhalb des Tumors induziert und den Zelltransport zu Lymphknoten verstärkt. Darüber hinaus ist eine erhöhte Lymphgefäßdichte in Tumoren mit einer erhöhten Metastasierung von Lymphknoten verbunden. . Daher untersuchten wir die Lymphgefäßbildung durch homologe Lymphgefäßhyaluronan (LYVE-1) -Immunfärbung in Shluc- und shp16-Mäusetumoren. Wir fanden heraus, dass die p16-Suppression zu einer geringeren Lymphgefäßdichte bei HPV / p16-positiven Xenotransplantaten führte, was auf eine doppelte Rolle von p16 bei der Metastasierung hindeutet (Abb. 2b).
Um die Funktion von p16 zu verstehen, konzentrierten wir uns auf Integrine, da diese Proteine als Schlüsselregulatoren der Angiogenese und Lymphangiogenese akzeptiert werden . Darüber hinaus ist die Bindung von p16 an Integrine und der Verlust der Zellausbreitung bereits dokumentiert . Integrine wie alpha4 beta1 sind wichtige Modulatoren der Lymphangiogenese . Daher untersuchten wir das Vorhandensein von alpha4 beta1 Integrin in SCC154 shluc und SCC154 shp16 Mäusetumoren. Although not statistically significant (p = 0.09), shluc tumors showed a higher percentage of integrin compared to shp16 tumors (Fig. 2c). In line with SCC154 shRNA xenografts, tumors from HPV/p16 positive SCC154 xenografts showed higher percentage of alpha4 beta 1 integrin compared to tumors from HPV/p16 negative SQD9 xenografts (Fig. 2d).