Bakteriophagen, auch Phagen genannt, sind Viren, die Bakterien spezifisch infizieren, und wir können ihre Anwesenheit bestätigen und quantifizieren sie mit einem Tool namens Plaque-Assay. Bakteriophagen infizieren ihre anfälligen Wirte, indem sie sich zuerst an die bakterielle Zellwand anlagern und ihr genetisches Material injizieren. Dann entführen sie die Biosynthesemaschinerie der Zelle, um ihre DNA zu replizieren und zahlreiche Nachkommensphagenpartikel zu produzieren, die sie dann durch Lysieren und Abtöten der Wirtszelle freisetzen.

Diese lytische Aktivität ist die Grundlage einer weit verbreiteten Phagenaufzählungstechnik, die als Plaque-Assay oder Double-Agar-Layer-Assay bekannt ist. Hier wird zunächst eine Bakteriophagenmischung in einer geschmolzenen Nährstoffbrühe hergestellt, die Agar niedriger Konzentration enthält. Alle in der Mischung verwendeten Bakterien sollten in der ersten Phase ihres Wachstums lebendig sein und sich aktiv teilen, wodurch sichergestellt wird, dass ein großer Prozentsatz der Bakterien lebensfähig ist und einen dichten Rasen um die Plaques bilden kann. Als nächstes wird diese geschmolzene Bakterien-Phagen-Agar-Mischung über ein festeres, konzentrierteres Agar-Nährmedium verteilt, das bereits auf einer Petrischale verfestigt ist. Bei Inkubation bei Raumtemperatur verfestigt sich die niedrigkonzentrierte Agar-Phagen-Bakterien-Brühe ebenfalls zu einem weichen Agar-Overlay.

Hier können die Bakterienzellen zusätzliche Nährstoffe aus der unteren Schicht ableiten und sollten sich schnell vermehren, um einen konfluenten Bakterienrasen zu erzeugen. Da Phagenpartikel jedoch auch in der weichen Schicht vorhanden sind, infizieren und replizieren diese ihr genetisches Material innerhalb der Bakterien, was zur Zelllyse führt, bei der mehrere Nachkommen freigesetzt werden. Diese Phagennachkommen infizieren dann die benachbarten Zellen, da der halbfeste Zustand der Bakterien-Phagen-Schicht ihre Bewegung auf weiter entfernte Wirtszellen einschränkt. Dieser Zyklus von Infektion und Lyse setzt sich über mehrere Runden fort und tötet eine große Anzahl von Bakterien in einem lokalisierten Bereich ab. Die Wirkung der benachbarten Zellen zerstört wird, ist eine einzige kreisförmige klare Zone zu erzeugen, eine Plaque genannt, die mit bloßem Auge gesehen werden kann, effektiv die Bakterien lytische Aktivität des Phagen zu verstärken und ihre Aufzählung zu ermöglichen.Die Anzahl der Plaques auf einer Petrischale wird als Plaque-bildende Einheiten oder PFUs bezeichnet und sollte, sofern die anfängliche Bakteriophagenkonzentration ausreichend verdünnt war, direkt der Anzahl der infektiösen Phagenpartikel in der Originalprobe entsprechen. Diese Technik kann auch zur Charakterisierung der Plaque-Morphologie, zur Identifizierung von Phagentypen oder zur Isolierung von Phagenmutanten verwendet werden. In diesem Labor lernen Sie, wie Sie den Plaque-Assay zur Aufzählung von Phagen am Beispiel des T7-Phagen von E. coli durchführen.

Identifizieren Sie zunächst ein geeignetes Medium für die Kultivierung der Wirtsbakterienzellen und des Bakteriophagen. Hier wurde Lysogeniebrühe oder LB-Medium verwendet, um E. coli und den T7-Phagen zu kultivieren. Als nächstes nehmen Sie drei saubere Glasflaschen und beschriften Sie sie mit Medien, Namen und dann die erste als LB-Brühe, die zweite als LB-Bottom-Agar und die dritte als LB-Top-Agar. Wiegen Sie nun vier Gramm vorformuliertes LB-Pulver in drei Sätzen ab und geben Sie dann einen Satz gewogener getrockneter Medien in jede Flasche. Geben Sie 200 Milliliter Wasser in die erste Flasche. Mischen Sie den Inhalt mit einem Magnetrührstab.

Dann mit einem pH-Meter und ständigem Rühren den endgültigen pH-Wert durch Zugabe von Natriumhydroxid oder Salzsäure auf 7,4 bringen. Wiederholen Sie die Wasserzugabe und pH-Einstellung auch für die anderen beiden verbleibenden Flaschen. Wiegen Sie nun drei Gramm Agarpulver ab und geben Sie es in die zweite Flasche, um einen 1,5% igen Bodenagar herzustellen. Schließlich wiegen 1. 2 gramm Agar und fügen Sie es in die dritte Flasche, um die .6 % LB Top Agar. Der Brühzustand in der Flasche Man braucht keinen Agarzusatz. Verschließen Sie die Flasche halbdicht und sterilisieren Sie die Medien anschließend 20 Minuten lang bei 121 Grad Celsius im Autoklaven. Nehmen Sie nach Abschluss die Medienflaschen aus dem Autoklaven und drehen Sie sofort die Flaschenverschlüsse, um sie vollständig zu verschließen, um eine Kontamination zu vermeiden. Bewahren Sie die LB-Broth- und LB-Top-Agar-Medien zur späteren Verwendung auf der Bank auf. Legen Sie den LB-Bottom-Agar zum Abkühlen in ein Wasserbad, das auf ungefähr 45 Grad Celsius voreingestellt ist.

Wenn der LB-Bottom-Agar ungefähr 45 Grad Celsius erreicht, übertragen Sie ihn auf die Werkbank. Als nächstes sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70 % Ethenol. Als nächstes werden 450 Mikroliter steriles ein molares Calciumchlorid zu dem geschmolzenen Bodenagar gegeben, um eine Endkonzentration von 2 zu erhalten.25 millimolar. Schwenken Sie die Flasche vorsichtig zum Mischen. Stellen Sie dann sieben saubere Petrischalen auf. Beschriften Sie jedes Gericht unten mit dem Mediennamen und dem Zubereitungsdatum. Gießen Sie dann 15 Milliliter des Bodenagars in jede der sieben Petrischalen. Lassen Sie die Platten einige Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur aushärten. Nach dem Aushärten können die Kulturplatten bei Bedarf mehrere Tage bei vier Grad Celsius kopfüber gelagert werden, um die Kondensation zu minimieren. Übertragen Sie die Petrischalen eine Stunde vor dem Assay aus dem Vier-Grad-Celsius-Kühlschrank in einen 37-Grad-Celsius-Inkubator.

Am Tag vor der Durchführung des Assays sollten die E. coli kultiviert werden. Hier wurden 10 Mikroliter E. coli Kultur in 10 Milliliter LB-Brühe inokuliert. Legen Sie die Bakterien über Nacht in einen Schüttelinkubator, der auf 37 Grad Celsius bei 160 U / min eingestellt ist. Entfernen Sie dann am Tag des Tests die Bakterienkultur aus dem Inkubator. Säen Sie eine frische 10 Milliliter frische Gemüsebrühe mit 0,5 Milliliter der Übernachtkultur. Platzieren Sie diese Zellen, um in einen Schüttelinkubator zu wachsen, der auf 37 Grad Celsius bei 160 U / min eingestellt ist. Verwenden Sie als nächstes ein Spektralphotometer, um zu überprüfen, wann diese Kultur das Wachstum der Log-Phase erreicht, was durch eine optische Dichte von 0, 5 bis 0, 7 angezeigt wird. Sobald die OD dieses Niveau erreicht hat, stoppen Sie die Inkubation, indem Sie die Zellkultur auf die Bank übertragen. Sie sind jetzt bereit, für Phagen-Overlay-Assays verwendet zu werden.

Phagen-Titer können exponentiell über verschiedene Phagentypen und Proben variieren. Um sie effektiv zu zählen, sollten sie verdünnt werden, um eine breite Palette von Phagenkonzentrationen zu erzeugen. Erzeugen Sie am Tag des Tests eine Reihe von Phagenverdünnungen im Bereich von einem Zehntel bis zu einer millionsten Konzentration nach einer 10-fachen Verdünnungstechnik. Um statistisch signifikante und genaue Daten zu erhalten, führen Sie die serielle Verdünnung in dreifacher Ausfertigung durch.Als nächstes schmelzen Sie den verfestigten LB-Top-Agar mit einer Mikrowelle. Legen Sie es dann eine Stunde lang in ein Wasserbad, das auf 45 Grad Celsius eingestellt ist. Sammeln Sie nach einer Stunde die Petrischalen mit der unteren Agarschicht aus dem Inkubator. Beschriften Sie die Platten mit Phagenkonzentration und Testdatum. Dann legen Sie sieben saubere Reagenzgläser aus. Beschriften Sie jedes Reagenzglas mit der seriellen Phagenverdünnungsnummer und bestimmen Sie eines als Kontrolle.

Wenn der LB-Top-Agar 45 Grad Celsius erreicht, übertragen Sie ihn auf die Werkbank. Fügen Sie nun 450 Mikroliter ein molares Calciumchlorid zu dem 200 Milliliter Agar hinzu, um eine Endkonzentration von 2,25 Millimolar zu erhalten. Schwenken Sie die Flasche vorsichtig zum Mischen. Als nächstes werden 35 Milliliter LB-Top-Agar und vier Milliliter Bakteriensuspension in ein steriles konisches Röhrchen gegeben. Sanft schwenken, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, aber Schütteln vermeiden, um Schaumbildung zu verhindern.

Geben Sie nun fünf Milliliter dieser Bakterien-Agar-Mischung in jedes der sieben Reagenzgläser. Übertragen Sie dann 100 Mikroliter der seriell verdünnten Bakteriophagenproben und Kontrollmedien, die einfach Medien ohne Bakteriophagen sein sollten, in die respektvoll beschrifteten Reagenzgläser. Schwenken Sie die Mischung vorsichtig, um ein ordnungsgemäßes Mischen zu gewährleisten. Übertragen Sie vorsichtig fünf Milliliter Bakteriophagenmischung auf die jeweilige Petriplatte. Verteilen Sie die Mischung gleichmäßig auf der gesamten Oberfläche, indem Sie die Petriplatte vorsichtig verwirbeln.

Sobald alle Petriplatten mit der Mischung geschichtet sind, lassen Sie die Verfestigung der oberen Schicht durch 15-minütiges Inkubieren bei Raumtemperatur zu. Nach Abschluss dieser Schritte wiederholen Sie den Vorgang für den zweiten und dann den dritten Satz der Petrischalen unter Verwendung der verbleibenden zwei Sätze von Phagenverdünnungen. Jede Schale mit Parafilm verschließen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Stellen Sie die Kulturplatte 24 Stunden lang oder bis sich Plaques entwickeln, bei einer geeigneten Temperatur auf den Kopf. Hier wurden die Platten für einen Tag in einen 37-Grad-Celsius-Inkubator gestellt, eine stimulierende Wachstumsbedingung für E. coli und der T7-Phage.

Plaques erscheinen nach ein bis fünf Tagen Inkubation, abhängig von der Bakterienart, den Inkubationsbedingungen und der Wahl des Mediums. Hier waren Plaques nach einem Tag Inkubation bei 37 Grad Celsius sichtbar. Überprüfen Sie zunächst die mit Kontrolle gekennzeichneten Platten und stellen Sie sicher, dass sich in diesen Platten keine Plaques gebildet haben, da dies auf eine virale Kontamination hindeuten würde. Um den Phagentiter in der Originalprobe zu bestimmen, beginnen Sie zuerst mit den Platten, die die am stärksten verdünnte Phagenprobe enthalten, und zählen Sie die Plaques, ohne die Deckel zu entfernen. Wiederholen Sie die Zählung für jede Platte in jedem Satz. Einige Platten haben möglicherweise zu viele oder zu wenige Plaketten, um gezählt zu werden. Betrachten Sie 10 bis 150 als ideale Plaquezahl.

Erzeugen Sie als Nächstes eine Tabelle mit den Plaque-Zahlenwerten für die verschiedenen Verdünnungen und Replikate. Berechnen Sie dann die mittleren Plaque-Zahlenwerte für die Verdünnungsplatten, die die ideale Anzahl von Plaque-Zählungen enthielten. In diesem Beispiel waren dies die durchschnittliche Anzahl der Plaques, die in den 10 bis minus drei und 10 bis minus vier Verdünnungsplatten gebildet wurden. Stellen Sie nun den Phagenverdünnungsfaktor ein, indem Sie die erhaltenen mittleren Plaque-Werte durch die jeweiligen Phagenverdünnungsfaktoren dividieren. Hier wurde die durchschnittliche Anzahl der Plaques, die zu den 10 zu den minus drei und 10 zu den minus vier Verdünnungsplatten gebildet wurden, durch ihre jeweiligen Verdünnungsfaktoren geteilt, um die Anzahl der Plaque bildenden Einheiten oder PFUs in 100 Mikrolitern Phagenmischung zu erhalten. Um den Wert in PFU pro Milliliter umzurechnen, multiplizieren Sie die erzeugten Werte mit 10, da während des Bakteriophagen-Overlay-Herstellungsschritts nur 100 Mikroliter Phagenverdünnungsmischung verwendet wurden, wodurch ein zusätzlicher Verdünnungsfaktor von 10 erzeugt wurde. Berechnen Sie schließlich den Durchschnitt der Werte, die aus den verschiedenen Verdünnungsplatten erhalten wurden. Dies ergibt die durchschnittliche Anzahl von PFUs pro Milliliter. Die Anzahl der PFUs entspricht der Anzahl der infektiösen Phagenpartikel in der Originalprobe.