Der Androgenrezeptor (AR) ist ein Mitglied der Steroidhormon-Kernrezeptor-Superfamilie, die Östrogen-, Gestagen-, Glucocorticoid- und Mineralocorticoidrezeptoren umfasst.1 Die Bindung des prototypischen, endogen produzierten Androgens Testosteron (1) und des wichtigen aktiven Metaboliten Dihydrotestosteron (2) an AR löst eine bemerkenswert vielfältige Reihe biologischer Aktivitäten aus, die je nach Geschlecht, Alter und Hormonstatus eines Probanden variieren können. Die Aktivität von AR ist entscheidend für die normale menschliche sexuelle Entwicklung und Funktion, aber über diese Signaturrolle hinaus hat die AR-Aktivierung auch wichtige Auswirkungen auf verschiedene Ziele wie Knochen, Leber, Muskeln und das zentrale Nervensystem.2,3 Das therapeutische Potenzial der Androgensignalisierung wird in der medizinischen Chemie sehr geschätzt, und seit geraumer Zeit suchen Chemiker nach Verbindungen, die selektiv das Muskel- und Knochenwachstum stimulieren und gleichzeitig die proliferativen und / oder hypertrophen Wirkungen auf Geschlechtsgewebe wie die Prostata bei Männern und die Klitoris bei Frauen minimieren.4,5 Solche Mittel sind selektive Androgenempfängermodulatoren oder SARMs genannt worden. In dieser Hinsicht wird das prototypische und endogene Androgen Testosteron als logischer Benchmark-Komparator angesehen. Verbindung 3 ist das GTx SARM S-22 und Verbindung 4 ist das BMS SARM 562929, von denen beide in der Literatur als oral wirksame Verbindungen mit Selektivität für Muskel über Prostata relativ zu Testosteron in verschiedenen präklinischen Modellen berichtet wurden.6,7

Die Möglichkeit, Verbindungen mit gewebeselektiven Aktivitäten zu erhalten, die sich von denen des endogenen Referenztestosterons unterscheiden, könnte sich aus der Tatsache ergeben, dass auf die typische AR-Rezeptoraktivierung, die durch die Bindung eines Moleküls mit Affinität für das AR an die AR-Ligandenbindungsdomäne ausgelöst wird, dann eine ziemlich bemerkenswerte, koordinierte Reihe von Wechselwirkungen folgt: Diese können eine Änderung der Rezeptortopologie, Dissoziation von Hitzeschockproteinen, Rezeptordimerisierung, Rezeptorphosphorylierung, schnelle Signalereignisse, Translokation in den Kern (AR), Assoziation mit vielen verschiedenen koregulatorischen Proteinen zur Bildung eines Transkriptionskomplexes umfassen, der zur Aktivierung oder Unterdrückung der RNA-Synthese aus AR-modulierten Genen und schließlich zum Rezeptorabbau führt.8 Da jede Rezeptor-Ligand-Komplex-Topologie für diese Ligandenstruktur einzigartig ist, kann man erkennen, dass die Wechselwirkung eines bestimmten Ligand−Rezeptor-Komplexes mit koregulatorischen Proteinen wahrscheinlich auch für diesen Liganden einzigartig ist. Da sich das Expressionsniveau von AR, die Konstellation und das Expressionsniveau von koregulatorischen Proteinen und die Muster posttranskriptioneller regulatorischer Ereignisse in jeder Art von Androgen-Zielzelle unterscheiden und sich die Topographie der AR-Regulationsstellen im Genom bei jedem Gen unterscheidet, bietet diese bemerkenswerte Choreographie von Ereignissen und Interaktionen eine reiche Umgebung, in der man nach SARMs suchen kann, die ein wünschenswertes Muster der gewebeselektiven Pharmakologie aufweisen, wie z. B. hohe anabole, aber begrenzte androgene Aktivität.

Unser Verständnis des Ursprungs der SARM-Selektivität wird durch die „Bioamplifikation“ des primären endogenen Androgentestosterons weiter erschwert. Interessanterweise dient das endogen produzierte und sehr wichtige Androgentestosteron als eine Art „Anti-SARM“ oder „inverse SARM“, da seine androgene Aktivität durch Umwandlung in das stärkere 5α-Dihydrotestosteron durch das 5α-Reduktase-Enzym in bestimmten Geweben einschließlich Kopfhaut und Prostata erhöht wird (aber nicht in Muskel oder Knochen). Infolgedessen zeigen Androgene, die einer solchen Bioverstärkung in der Prostata nicht unterzogen werden, eine verbesserte Selektivität in Bezug auf Muskel und Prostata im Vergleich zu einer mit Testosteron behandelten Kontrolle oder einem intakten Tier, dessen primäres endogenes Androgen Testosteron ist.9 Allgemeiner ausgedrückt, könnte man erkennen, dass metabolische Unterschiede zwischen endogenen Androgenen wie Testosteron oder Dihydrotestosteron und SARMs auch für zumindest einige Selektivitätsunterschiede bürgen können.

Unsere Arbeit im SARM-Bereich führte zur Synthese und Auswertung einer Vielzahl von Kandidatenvorlagen. Während wir es relativ einfach fanden, Verbindungen mit hoher Affinität für AR zu erhalten, hatten wir Schwierigkeiten, Verbindungen zu erreichen, die eine gute orale Wirksamkeit und eine hohe In-vivo-Verträglichkeit zeigten. Nach dem Scannen vieler potenzieller Ableitungen auf orale In-vivo-Aktivität gelangten wir durch eine Kombination aus synthetischen Zwischentests, Literaturauswertung und Fragmentkombination zu Verbindung 5 mit hoher Affinität. Wir waren begeistert, als 5 orale Aktivität bei Ratten zeigte.

Als wir jedoch eine pharmakokinetische Analyse an Ratten durchführten, konnten wir nach oraler Dosierung nur sehr niedrige 5-Spiegel nachweisen (F < 5%). Weitere Analysen ergaben, dass 5 in vivo effizient in 6 umgewandelt wurde, vermutlich durch Cytochrome P450 in der Rattenleber.10 Verbindung 6 hatte eine ähnliche Aktivität wie Verbindung 5 in vivo, was darauf hindeutet, dass 6 weitgehend für die Aktivität von Verbindung 5 verantwortlich war.11 Ein In-vitro-Screening mit humanen Mikrosomen ergab einen schnellen Metabolismus von Verbindung 5, was auf diese Transformation als potenzielle metabolische Haftung des Menschen hinweist und uns veranlasste, Verbindungen herzustellen, bei denen die 4′-Position des Pendanten Phenyl durch P450-induzierte Hydroxylierung blockiert wurde.12 Wir untersuchten mehrere Analoga, die eine 4′-blockierende Gruppe enthielten, und identifizierten im Laufe unserer Bemühungen Verbindung 7 (RAD140; Abbildung 1) 1) als unseren präklinischen Entwicklungskandidaten.

Die Synthese von Verbindung 7 ist in Schema 1.13 gezeigt,14 Wir stützten uns auf eine zügige ipso-Fluor-Substitution des linken Vorläufers, Stück 8, mit d-Threonin in Gegenwart von K2CO3 in DMSO, um das gewünschte Produkt 9 in verarbeitbaren Ausbeuten zu erhalten (typischerweise >50%). Das d-Thr-Addukt 9 wurde mit 4-Cyanobenzohydrazid unter Standardkupplungsbedingungen mittels EDCI und HOBt gekoppelt. Das erhaltene Produkt 10 wurde mit TBDMS-Cl silyliert, in Gegenwart von TPP/I 2 dehydratisierenden Cyclisierungsbedingungen unterworfen und anschließend für den letzten Schritt desilyliert.15-17 Insgesamt hat sich dies als zuverlässige und effiziente Synthese unter Verwendung einer relativ kostengünstigen, wenn auch nicht proteinogenen Aminosäure als Chiralitätsquelle erwiesen.

Die Stabilität von RAD140 war hoch (t1/ 2 > 2 h) in Inkubationen mit Ratten-, Affen- und menschlichen Mikrosomen und hatte auch eine gute Bioverfügbarkeit bei Ratten (F = 27-63%) und Affen (65-75%). RAD140 zeigte eine ausgezeichnete Affinität zum Androgenrezeptor (Ki = 7 nM gegenüber 29 nM für Testosteron und 10 nM für DHT) sowie eine gute Selektivität gegenüber anderen Steroidhormon-Kernrezeptoren, wobei der nächstgelegene Zielrezeptor der Progesteronrezeptor ist (IC50 = 750 nM gegenüber 0,2 nM für Progesteron).18in vitro funktionelle Androgen-Agonisten-Aktivität wurde in der C2C12 Osteoblasten-Differenzierung Assay bestätigt, wo eine EC50 von 0,1 nM gezeigt wurde (DHT = 0,05 nM).19

RAD140 wurde in einer Reihe von In-vivo-Assays charakterisiert, um seine orale Wirksamkeit bei einer Reihe von Parametern zu bestimmen, die mit androgener Aktivität in präklinischen Modellen assoziiert sind. Zum Beispiel wurde RAD140 in den jungen kastrierten und intakten männlichen Ratten dosiert, um seine Effekte durch eine Strecke der endogenen androgenen signalisierenden Hintergründe festzusetzen. Die junge kastrierte Ratte liefert einen sehr empfindlichen in vivo-Test für androgene Aktivität, da das Tier relativ androgen-naïv ist; Somit wird jede Signalaktivität von einem exogen verabreichten Androgen einem im Wesentlichen leeren Hintergrund überlagert.20 In Abbildung Figure2,2, die Wirkung von steigenden Dosen von oral verabreichtem RAD140 (0.5% Methylcellulose) auf Levator ani Bulbocavernosus Muskel („Levator ani“ oder „LABC“) Gewicht und Prostatagewicht ist relativ zu Vehikel (kastrierte Kontrolle), Schein (nicht kastrierte Kontrolle) und Testosteronpropionat (TP) subkutan bei 1 mg / kg in Maisöl dosiert.21 Wie zu sehen ist, stimuliert RAD140 den Musculus levator ani beginnend mit einer Dosis von 0,03 mg / kg (po) und erreicht ein Wirksamkeitsniveau, das dem des Schein-operierten Tieres bei 0,3 mg / kg entspricht.

Da wir konsequent beobachteten, dass RAD140 bei 1 mg / kg kein Niveau der Prostata- oder Samenbläschenstimulation erreichte, das TP entsprach (unabhängig davon, wie hoch die Dosis von RAD140 war), beschlossen wir zu testen, ob RAD140 die Wirkung von TP auf Rattenprostata und Samenbläschen antagonisieren und gleichzeitig bestimmen konnte, welche Wirkung die gleichzeitige Verabreichung von RAD140 und TP auf den Levator-Ani-Muskel haben könnte. Aus den in Abbildung 3,3 gezeigten Ergebnissen geht hervor, dass eine hohe Dosis von RAD140 (10 mg / kg, po) tatsächlich die Wirkung von TP bei 1 mg / kg auf die Samenbläschen antagonisiert, aber die Wirkung von TP auf den Levator-Ani-Muskel verstärkt. Wir konnten feststellen, dass die effektive Dosis zur Erzielung eines Antagonismus durch RAD140 0,3−1 mg / kg (po) für 1 mg / kg TP (sc) beträgt (Daten nicht gezeigt). In der Prostata verursachte RAD140 auch einen Abwärtstrend bei der Stimulation durch TP, aber die Veränderung erreichte keine statistische Signifikanz. So im jungen kastrierten männlichen Rattenmodell, scheint RAD140, ein starker und vollständiger Androgenagonist auf dem levator ani, aber ein schwächerer, teilweiser Antagonist auf dem Samenbläschen und möglicherweise der Prostata zu sein.22

Das Ziel der meisten präklinischen In-vivo-Modelle ist es, am besten vorherzusagen, wie sich ein Medikament in der Zielpopulation des Medikaments verhalten wird. Bei der Betrachtung der Frage, wie stimulierend ein Androgen auf einem bestimmten Gewebe in einem präklinischen Modell ist, sollte berücksichtigt werden, dass das Hintergrundniveau der Androgensignalisierung die bei einem Tier beobachtete Reaktion beeinflussen kann. Das kastrierte Rattenmodell weist Einschränkungen auf, da der sehr niedrige endogene Androgenspiegel in diesem Modell eine künstliche Situation ist, die sich nicht in der männlichen erwachsenen menschlichen Zielpopulation widerspiegelt.23 Insbesondere wird die männliche Zielpopulation einen androgenen Hintergrund deutlich über einem Kastraten haben, obwohl die Androgenspiegel wahrscheinlich niedriger sein werden als die Norm für ihre Gruppe.Um besser zu verstehen, wie diese Gruppe reagieren könnte, haben wir uns entschieden, junge intakte männliche Ratten zu betrachten, da sie endogenes Testosteron haben, aber in etwas reduziertem Ausmaß. Daher behalten sie die Empfindlichkeit der Prostata gegenüber einer androgenen Verbindung bei, weisen jedoch gleichzeitig eine Grundlinienstimulation auf, die der Zielpopulation ähnlicher ist als kastrierte Tiere. Wie in Abbildung 4,4 gezeigt, erhöhte RAD140 das Gewicht des Levator-Ani-Muskels über das der intakten Kontrolle, beginnend mit der niedrigsten getesteten Dosis (0,1 mg / kg). Interessanterweise zeigte RAD140 bis zur höchsten getesteten Dosis von 30 mg / kg keine Stimulation der Prostata über dem Kontrollniveau für intakte Tiere. Bei 0,3 mg / kg zeigte RAD140 eine Muskelwirksamkeit ähnlich der TP bei 0,5 mg / kg, aber eine Dosis von 30 mg / kg RAD140 war erforderlich, um die Prostatawirksamkeit von 0,5 mg / kg TP anzunähern.24 Aus dieser Studie geht hervor, dass RAD140 bei jungen intakten männlichen Ratten einen sehr breiten Selektivitätsbereich sowohl gegenüber TP-behandelten Ratten als auch gegenüber Schein-Kontroll-Ratten aufweist.

Schließlich waren wir daran interessiert, die Wirkung von RAD140 bei jungen, männlichen Cynomolgus-Affen zu untersuchen, um eine wirksame Dosierung bei einer unserer Meinung nach relevanteren präklinischen Spezies zu ermitteln. Wir führten eine relativ einfache, nicht terminale Studie durch, die es uns dennoch ermöglichte, anabole sowie Lipid- und andere klinisch-chemische Parameter zu bewerten. Um die anabole Aktivität zu beurteilen, haben wir uns zuerst das Bruttokörpergewicht angesehen, von dem wir wussten, dass es ein empfindlicher Marker für die anabole Androgenwirkung bei jungen nichtmenschlichen Primaten ist. Die Ergebnisse der 28-tägigen Dosierung von RAD140 mit 0,01 mg / kg, 0,1 mg / kg und 1 mg / kg am Tierkörpergewicht sind in Abbildung 55 dargestellt.

Aufgrund der kleinen Gruppengröße (n = 3 für jede Dosierungsgruppe) verwendeten wir die Hintergrundgewichtsänderung jedes Tieres für die Wochen vor dem Experiment, um die Basislinie als Kontrolle festzulegen. Da das mittlere Körpergewicht für jede Gruppe von drei Affen zu einer fast identischen Zahl konvergierte (Tag -1), wobei der absolute Körpergewichtsbereich zwischen den Gruppen nur 4,26−4,29 kg betrug, haben wir das absolute Körpergewicht in Abbildung 5.5 aufgetragen. In dieser Studie wurde eine mittlere Gewichtszunahme von mehr als 10% in nur 28 Tagen der Dosierung bei einer Dosis von nur 0,1 mg / kg erreicht, wobei ein ähnlicher Effekt bei der 1,0 mg / kg Dosierungsgruppe beobachtet wurde.26

Dual Energy X-ray Absorptiometry („DEXA“) -Scans aller Affen wurden zwei Tage vor Beginn der Dosierung und einen Tag nach der letzten Dosis (Tag -2 und Tag 29) durchgeführt, um die Auswirkungen von RAD140 auf mageres Gewebe und Fett zu bestimmen; Die Ergebnisse sind in Abbildung 6.6 dargestellt. Wie zu sehen ist, gab es keinen konsistenten Effekt auf die absolute Fettmasse, während der Muskel einen qualitativen Trend zeigte, der mit der Dosis zunimmt. Obwohl es scheint, dass der Großteil der in Abbildung 55 gezeigten Massenzunahme auf eine Zunahme der Magermasse zurückzuführen war, war keine der Gewebegewichtszunahmen statistisch signifikant (p > 0,05), was möglicherweise auf die kleinen Gruppengrößen (n = 3) und relativ große Standardabweichungen zurückzuführen ist.27

Die klinische Chemie zeigte die erwartete Senkung der Lipide (LDL, HDL, Triglyceride).28 Trotz des ziemlich dramatischen Anstiegs des Körpergewichts in so kurzer Zeit gab es bei keinem Tier eine Erhöhung der Leberenzym-Transaminase-Spiegel in irgendeiner Dosis >2-fach über dem Ausgangswert.29,30 Angesichts der gut etablierten Beziehung zwischen oralem Androgengebrauch und Leberstressindikatoren waren wir sehr erfreut, dass wir bei einer 10-fach höheren Dosis als der voll wirksamen Dosis minimale Leberenzymerhöhungen sahen.31in Summe hat RAD140 alle Merkmale eines SARM. Es ist potenzselektiv, da es Muskelgewichtszunahmen bei einer niedrigeren Dosis stimuliert als die, die erforderlich ist, um Prostatagewichtszunahmen zu stimulieren. Außerdem ist es auch Wirksamkeit selektiv, weil es völlig aufbauend auf Muskel ist, aber weniger als vollständige Wirksamkeit auf der Prostata und den Samenbläschen demonstriert und tatsächlich die Anregung der Samenbläschen teilweise antagonisieren kann, die durch Testosteron verursacht werden. RAD140 hat ausgezeichnete Pharmakokinetik und ist ein starkes aufbauendes in den nichtmenschlichen Primaten außerdem. Wir glauben, dass das präklinische Gesamtprofil von RAD140 sehr gut ist, und die Verbindung hat die präklinische Toxikologie sowohl bei Ratten als auch bei Affen abgeschlossen. Wir bereiten derzeit RAD140 für klinische Phase-I-Studien bei Patienten vor, die an schwerem Gewichtsverlust aufgrund von Krebskachexie leiden.