4.2.1 Polymerase II

Obwohl der Transkriptionsabbruch viel weniger erforscht wurde als seine Initiierung, haben die letzten 25 Jahre gezeigt, dass die zeitlich gut abgestimmte und genaue Freisetzung des entstehenden Transkripts und der RNA-Polymerasen aus der DNA-Vorlage für das Schicksal der RNA sowie für die allgemeine Genomerhaltung entscheidend ist.

Spätere Arbeiten ergaben, dass Rat1 in Hefe und Xrn2 beim Menschen für die Torpedoaktivität verantwortlich waren und dass das Fehlen eines der beiden Enzyme sowie des Rat1-Aktivators Rai1 in Hefe zu einem Terminierungsdefekt führt, der sich in einem umfangreichen Transkriptionsdurchlesen äußert. Es ist auch möglich, dass ein pflanzliches Rat1-Homolog, Arabidopsis AtXRN3, ähnlich wie Rat1 / Xrn2 als Transkriptionsabbruchfaktor wirkt. Hochdurchsatzansätze zeigten eine Akkumulation von nichtkodierenden Transkripten aus dem 3′-Ende von mRNA- und microRNA (miRNA) -Genen in der xrn3-Knockdown-Mutante, die transkriptionellen Read-Through-Molekülen entsprechen können . Somit kann AtXRN3 aufgrund seiner Torpedo-Terminationsaktivität an einer globalen RNA 3′-End-Überwachung teilnehmen.

Der Torpedomechanismus hängt von der Exonuklease-katalytischen Aktivität von Rat1 ab und nicht nur von seiner Anwesenheit . Das monophosphorylierte RNA-Substrat für Rat1 / Xrn2 während der mRNA-Synthese wird als Ergebnis einer cotranskriptionellen Spaltung (CoTC) an der Polyadenylierungsstelle durch die mRNA 3′-Endbildungsmaschinerie erzeugt. Genauer gesagt wird dieser Prozess durch die Ysh1-Komponente des CF II in Hefe oder die entsprechende CPSF-73-Untereinheit des humanen Spalt- und Polyadenylierungsspezifizitätsfaktors (CPSF) durchgeführt (überprüft in Ref. ). Zwei Faktoren wurden vorgeschlagen, um zu einer effizienten Beendigung beizutragen: die Stärke des Poly(A) -Signals und die Wirkung der Exonuklease, die das 5′-Spaltprodukt abbaut, was das Pausieren der Polymerase stromabwärts der Poly (A) -Stelle erleichtert und deren Freisetzung fördert. Andererseits hebt die beeinträchtigte Rat1-abhängige Terminierung die ordnungsgemäße Erkennung der Poly (A) -Stelle und die mRNA-Spaltung nicht auf.

Zusätzliche Rat1 / Xrn2-Eintrittsstellen können durch autokatalytische CoTC stromabwärts der Poly (A) -Stelle in Säugetieren oder endonukleolytische Spaltung durch Rnt1 in Hefe entstehen . Letzterer Fall wurde als ausfallsicherer Terminierungsmechanismus für proteinkodierende Gene gemeldet, der zusammen mit dem durch den Nrd1 / Nab3 / Sen1-Komplex (NRD) vermittelten Signalweg einen Backup-Modus für die Pol II-Freisetzung bereitstellt.

Obwohl Rat1 / Xrn2 für eine effiziente Pol-II-Terminierung erforderlich ist, löst Rat1 in vitro keine Terminierung aus, und seine 5′-3′-Abbauaktivität reicht nicht aus, um die Polymerasedissoziation in vivo zu fördern. Konsequent ist Hefe Xrn1, das zum Kern gerichtet wird, zum cotranscriptional Abbau von entstehender RNS fähig, aber rettet nicht die Beendigungsdefekte, die durch einen Rat1 Mangel verursacht werden. Diese Beobachtungen legen nahe, dass die Exonuklease, die mit der Polymerase aufholt, notwendig, aber nicht ausreichend ist, um den Elongationskomplex zu destabilisieren, und dass ein zusätzliches Element des Torpedomechanismus während der Beendigung arbeitet. Es wurde postuliert, dass ein einzigartiges Rat1-Merkmal, die Extended Tower Domain, die in Xrn1-Proteinen nicht vorhanden ist, für ihre Terminierungseigenschaften verantwortlich sein kann . Es ist denkbar, dass die Turmdomäne bestimmte Modifikationen erfährt oder als Schnittstelle für Wechselwirkungen mit terminationsfördernden Faktoren dient. Einer der möglichen Kandidaten für Faktoren, die die Rat1-abhängige Terminierung stimulieren, ist die RNA-Helikase Sen1, die eine Schlüsselkomponente des Terminierungsweges für nichtkodierende RNAs in Hefe darstellt (siehe unten), die auch zur Terminierung von proteinkodierenden Genen beiträgt, mit der stärksten Wirkung auf kürzere mRNAs . Sen1 interagiert über seine N-terminale Domäne mit der größten Pol-II-Untereinheit, Rpb1, und die Beeinträchtigung der Sen1-Helikase-Aktivität beeinträchtigt die genomweite Pol-II-Verteilung über kodierende und nicht kodierende Gene . Es wurde gezeigt, dass das humane Sen1-Homolog Senataxin den Xrn2-vermittelten Transkriptionsabbruch direkt fördert, indem es die RNA: DNA-Hybride (R-Schleifen) auflöst, die hinter dem verlängerten Pol II gebildet werden, vorwiegend an G-reichen Transkriptionsstellen stromabwärts der Poly (A) -Stelle . Diese Aktivität erleichtert den Zugang von Xrn2 zu Poly(A) site 3′-Spaltprodukten und trägt somit zur Rekrutierung der Torpedo-Exonuklease bei. Die Wirkungsweise von Hefe Sen1 wird als ähnlich angesehen .

Eine unbeantwortete Frage ist, wie Rat1 an die elongierende Polymerase rekrutiert wird. Mehrere Beobachtungen unterstützen die Assoziation von Rat1 über Proteine, die mit der C-terminalen Domäne Pol II (CTD) über ihre CTD-interagierende Domäne (CID) interagieren, nämlich die Pcf11-Untereinheit des Hefespaltungsfaktors IA (CFIA) und Rtt103 (Regulator der Ty1-Transposition 103). Rat1 und Rai1 sind an den Promotoren und kodierenden Regionen mit einer starken Anreicherung an den 3′-Enden der Gene vorhanden. Es wurde gezeigt, dass die funktionelle Interaktion zwischen Rat1 und Pcf11 das gegenseitige Corecruitment beider Faktoren erleichtert: Rat1 verbindet die Terminierung mit der 3′-End-Bildung, indem es die Rekrutierung von 3′-End-Verarbeitungsfaktoren, insbesondere der CFIA-Untereinheiten Pcf11 und Rna15, stimuliert, während Pcf11 zur Rat1-Assoziation über die Poly (A) -Stelle beiträgt . Es wurde auch gezeigt, dass humanes Pcf11 den Abbau von im Entstehen begriffener RNA verstärkt und den Transkriptionsabbruch fördert . Rtt103 wiederum, das auch nahe den 3′-Enden von Genen assoziiert ist, kopuliert mit Rat1, Rai1 und Pcf11 und erkennt zusammen mit Pcf11 kooperativ die Ser2-phosphorylierte CTD des elongierenden Pol II. Andererseits wird die Rat1-Verteilung über Gene in Abwesenheit von Rtt103 nicht verändert. Darüber hinaus beendet Rat1 auch die Transkription durch Pol I , dem eine CTD fehlt, was darauf hindeutet, dass die Rekrutierung von Rat1 auch über andere Mechanismen erfolgen kann. Tatsächlich wurde berichtet, dass die Assoziation von hXrn2 durch p54nrb / PFS (Protein-associated Splicing Factor) vermittelt wird, bei denen es sich um multifunktionale Proteine handelt, die an Transkription, Spleißen und Polyadenylierung beteiligt sind . Die Rolle von p54nrb / PFS bei der Pol-II-Transkriptionstermination wurde auch in C. elegans nachgewiesen.

Zusätzlich zu mRNAs synthetisiert Pol II eine breite Palette von nichtkodierenden Transkripten, einschließlich kleiner nuklearer RNAs und snoRNAs sowie einer Vielzahl instabiler RNAs. In Hefe wird die Transkription dieser relativ kurzen Spezies hauptsächlich durch einen alternativen NRD-Komplex beendet, der sich aus den RNA-bindenden Proteinen Nrd1 und Nab3 und der ATP-abhängigen Helikase Sen1 zusammensetzt . Da dieser Mechanismus höchstwahrscheinlich keine cotranskriptionelle endonukleolytische Spaltung mit sich bringt , wird angenommen, dass die Sen1-RNA: DNA–Hybrid-Abwickelaktivität für die Polymerasedissoziation essentiell ist, möglicherweise auf ähnliche Weise wie die bakterielle Rho-DNA-RNA-Helikase. Rho destabilisiert wahrscheinlich den Elongationskomplex, indem es entlang transloziert und die entstehende RNA aus der Polymerase entfernt . Ein alternatives, allosterisches Modell postuliert, dass Rho auf Polymerase geladen wird und an Terminationsstellen Umlagerungen im enzymaktiven Zentrum induziert . Beide Wirkweisen können durchaus für die Sen1-Helikase gelten.Obwohl Rat1 für snoRNA-Gene rekrutiert wird, insbesondere intronische, ist die NRD-abhängige Terminierung von snoRNA-Transkripten nicht beeinträchtigt, wenn sie fehlt, und es wurde daher vorgeschlagen, dass sie an einigen vorzeitigen Terminierungsereignissen beteiligt ist . Es ist jedoch immer noch möglich, dass der Rat1-Torpedo-Mechanismus zur Transkriptionsterminierung von snoRNAs wie U3 oder snR40 beiträgt, deren 3′-Ende durch Rnt1-Spaltung freigesetzt wird, die das verbleibende im Entstehen begriffene Transkript 5′-Ende für den Rat1-Angriff freilegt .Überraschenderweise wurde gezeigt, dass Rat1 mit Pcf11 an Telomeren und an den Pol III-transkribierten tRNA-, 5S rRNA- und SCR1-Genen kolokalisiert . Die funktionelle Bedeutung dieser Beobachtungen ist derzeit unklar, aber alternative Terminationsmodi dieser RNAs und der Abbau von aberranten Transkripten oder die Verarbeitung von instabilen nicht-kodierenden RNAs, wie telomere TERRA , sind eine Möglichkeit (Tabelle 7.1).