Cytopathic effect (CPE): how do viren get away with murder

Viren sind per Definition für unsere Augen unsichtbar. Es sind Nanostrukturen, die nur durch Elektronenmikroskopie sichtbar werden können, eine Technik, die zeitaufwändig und nicht für jedermann zugänglich ist. Infolgedessen muss ein Virologe Alternativen finden, um sein interessierendes Objekt bearbeiten und untersuchen zu können. Eine praktische Möglichkeit, eine Virusinfektion zu „sehen“ und indirekt zu messen, besteht darin, den Schaden zu betrachten, den ein Virus an einer Zelle verursacht. Dieses Leiden oder dieser Schaden ist als zytophatischer Effekt (CPE) bekannt und seine Messung ist in Virologielabors auf der ganzen Welt weit verbreitet.

CPE ist ein sehr grundlegender Ansatz, um zu verstehen, wie ein Virus eine Zelle infiziert, aber das bedeutet nicht, dass es nur in der wissenschaftlichen Grundlagenforschung verwendet wird. Die Messung von CPEs kann auch eine sehr nützliche Anzeige für Pharmaunternehmen und diagnostische Labors sein.

Was ist eine virusinduzierte zytophatische Wirkung?

Viren sind Parasiten, die eine Wirtszelle benötigen, um sich zu vermehren. Sobald sie sich in der Zelle befinden, entführen sie die zelluläre Maschinerie, um ihre eigenen Proteine, Nukleinsäuren und Membranen zu produzieren (wenn nötig). Da das Virus zelluläre Faktoren besetzt, die sonst von der Zelle genutzt werden, kann seine Replikation die Grundfunktionen der Wirtszellen verändern oder sogar zerstören. Die Zellveränderungen oder -veränderungen, die aus einer Virusinfektion resultieren, werden als CPEs bezeichnet. Dies sind normalerweise negative Veränderungen, die strukturelle, metabolische oder funktionelle Veränderungen in der infizierten Zelle verursachen können. Im Laufe der Zeit kann CPEs zu den pathologischen Auswirkungen des Virus (der Krankheit) führen.

Klassische Beispiele für den zytopathischen Effekt

Ein bekanntes virus-induziertes CPE ist der Zelltod (schauen Sie sich ein Video einer sterbenden Zelle an ). Viele Viren töten Zellen entweder durch Lyse oder durch Apoptose ab. Zum Beispiel ist HIV dafür bekannt, CD4 + T-Lymphozyten abzutöten, was der Hauptgrund dafür ist, dass infizierte Personen immungeschwächt werden.

Im Labor ist eine einfache Möglichkeit, eine Mückenzelllinie (wie C6 / 36) oder Vero-Zellen abzutöten, die Infektion mit einem bekannten Arbovirus wie Chikungunya, Dengue oder Zika. Nach einigen Tagen der Infektion fallen die Zellen direkt vor Ihren Augen auseinander (Abb. 1).

Abbildung 1 / Vero-Zellen wurden mit dem Zika-Virus infiziert. Nach 72 h Infektion ist ein klares CPE durch das Vorhandensein von Zelldebri infolge des Zelltods erkennbar.

Ein weiteres CPE-Beispiel ist die Synzytienbildung. Zellen, die mit umhüllten Viren infiziert sind, exprimieren virale Proteine auf ihrer Plasmamembran, die von Viren zur Vermittlung der Fusion mit der Wirtszelle verwendet werden. Wenn diese viralen Proteine an Rezeptoren auf der Oberfläche benachbarter Zellen binden, findet eine Zell–Zell-Fusion statt, die zur Bildung von Synzytien (mehrkernige Riesenzelle) führt.

Respiratory Syncytial Virus (RSV) ist die Hauptursache für virale Pneumonie bei kleinen Kindern. Sein Name leitet sich von der Tatsache ab, dass es Synzytien in Zellkultur, aber bemerkenswerterweise auch in der Lunge infizierter Patienten bilden kann.

CPE-bedingte Veränderungen der Zellmorphologie umfassen auch das Abrunden, Ablösen und/oder Verklumpen von adhärenten Zellen. In diesem Fall bleiben infizierte Zellen metabolisch aktiv, um das Virus zu replizieren, aber ihr Zytoskelett ist verändert. Die morphologischen Veränderungen lassen sich durch eine Herunterregulierung der Expression von Oberflächenadhäsionsproteinen infolge einer Infektion erklären. Es ist beispielsweise bekannt, dass das Ebola-Virus dramatische morphologische Veränderungen in adhärenten Zellen verursacht, indem es die Expression von Integrin β1 verringert.

Braucht man wirklich so viel Drama (Tod, Gigantismus, Deformation), um als CPE zu gelten? Nein. Zellen können sich bei einer Infektion einfach anders „verhalten“, sehen aber gleich aus. Subtilere, aber immer noch klare Veränderungen vom CPE-Typ können Veränderungen der Wachstumsrate / Kinetik, Veränderungen einer bestimmten Stoffwechselaktivität oder Veränderungen der Zellfunktion umfassen. Unter den verschiedenen Viren, die diese Arten von CPEs induzieren können, steht das Zika-Virus. Im Jahr 2015 war dieses durch Mücken übertragene Virus in den Nachrichten, weil es Mikrozephalie verursacht, eine schwere neurologische Schädigung, die durch eine verringerte Größe des Gehirns bei Föten gekennzeichnet ist. Später wurde beschrieben, dass Mikrozephalie das Ergebnis mehrerer Zika-induzierter zytopathischer Wirkungen auf Nervenzellen ist, einschließlich Zellhypertrophie, Wachstumsbeschränkung, Dysregulation des Zellzyklus und Zelltod. Ein Koloniebildungstest wurde beispielsweise verwendet, um zu identifizieren, welche der verschiedenen Zika-Proteine die Zellproliferation stören.

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Zytopathische Effekte sind das Ergebnis von Virus-Wirt-Interaktionen

Es ist wichtig zu erwähnen, dass das CPE nicht nur vom Virus, sondern auch von der Wirtszelle definiert wird. Es hängt davon ab, wie permissiv die Zellen für Infektionen sind. Eine permissive Zelle zu sein, die das Wachstum eines Virus unterstützen kann. Mit anderen Worten, nicht alle Viren können alle Zelltypen infizieren. Um es einfach zu halten, können wir Folgendes sagen:

• Nicht permissives Zellvirus kann nicht infizieren
• Permissives Zellvirus kann sich replizieren, verursacht aber kein offensichtliches CPE
• Hochpermissives Zellvirus repliziert und induziert ein offensichtliches CPE

Wenn Sie also Ihren Zellen Viren hinzufügen und nichts passiert, machen Sie sich keine Sorgen. Sie müssen nur die richtige Virus-Zell-Kombination finden.

Anzeigen – Wie misst man CPE?

Virusinduzierte zelluläre Veränderungen wie Zelltod oder eine veränderte Morphologie sind lichtmikroskopisch sichtbar. Sie können Ihre Platte einfach unter ein Standard-invertiertes Mikroskop stellen und sehen, ob Ihre Zellen gestorben sind oder sich irgendwie verändert haben. Ein positiver Aspekt dieses Ansatzes ist, dass er „einfach“ ist, da keine Verarbeitung der Probe erforderlich ist, wodurch Fixierungs- oder Färbeartefakte vermieden werden.

Auf der anderen Seite ist es qualitativ und nicht quantitativ, und es hängt stark von der Ausbildung des Beobachters ab. Heutzutage kann dieser Ansatz automatisiert werden, indem die virusinduzierte Zytopathogenese in Echtzeit überwacht wird. Beispielsweise können Virusveränderungen der Zellausbreitung und -proliferation durch einen Wundheilungstest beurteilt werden, bei dem eine verringerte kollektive und Einzelzellmigrationsgeschwindigkeit zusammen mit starken Veränderungen der Zellmorphologie nachgewiesen werden kann. Ein weiterer quantitativer Ansatz ist die Überwachung der Zellproliferation durch automatisierte Bildanalyse. Mit dieser Technologie ist es möglich, Wachstumskurven von infizierten vs. nicht infizierte Zellkulturen, um die zytopathische Wirkung einer Virusinfektion richtig zu quantifizieren.

Wenn Todeszellen Ihren Tag ausmachen, ist eine Alternative der berühmte Plaque-Assay. Diese klassische virologische Technik wird zur Quantifizierung infektiöser Viruspartikel eingesetzt und basiert auf dem Prinzip, dass Viren eine Zelllyse induzieren können. Nach der Infektion einer Monoschicht hochpermissiver Zellen werden die Zellen mit Kristallviolett gegengefärbt (lebende Zellen sind gefärbt, Todeszellen bleiben ungefärbt), was zu schönen Plaques (Bereichen von Todeszellen) führt, die mit bloßem Auge leicht quantifiziert werden können.

Aber Sie müssen Ihre Zellen nicht sehen, um zu wissen, dass sie sterben. Die Zelllebensfähigkeit nach der Infektion kann durch Quantifizierung der intrazellulären ATP-Konzentration mit Firefly-Luciferase oder mit dem traditionellen MTT-Assay gemessen werden.

Die Arbeit mit Viren kann mühsam sein, BSL-3/4-Labore haben strenge Sicherheitsmaßnahmen und das Ein- und Aussteigen aus dem Labor nimmt viel Zeit in Anspruch. Für Forscher, die nach einer Lösung suchen, um ihre Zellen zu überwachen, ohne das Labor betreten zu müssen, empfehlen wir das CytoSMART Lux2 Duo Kit.

Anwendungen

Induziert Ihr Virus eine CPE? Können Sie es deutlich sehen oder messen? Großartig! Sie können diese CPE als Auslesen einer erfolgreichen Virusinfektion oder Replikation verwenden. Ein gegebenes CPE kann als Indikator dienen, um herauszufinden, wie eine Infektion verhindert werden kann, um Wirts- oder Pathogenfaktoren zu charakterisieren, die für eine Infektion erforderlich sind, um unter anderem Virustropismus zu identifizieren. In der Praxis bedeutet dies, dass es als Anzeige verwendet werden kann für:

• Screening und Bewertung einer antiviralen Verbindung
  Kann ein Wirkstoffkandidat die CPE-Bildung verhindern?
• Screening auf neutralisierende Antikörper
  Kann ein bestimmter Antikörper virusinduziertes CPE hemmen?
• Überwachung der Resistenz gegen antivirale Medikamente (Phänotypisierung)
  Kann ein bestimmtes Virusisolat in Gegenwart von antiviralen Medikamenten CPE induzieren?
• Charakterisierung des Virustropismus
  Welche Zelltypen werden bevorzugt von einem Virus infiziert? Warum? (Überprüfen Sie eine aktuelle Veröffentlichung mit dem berüchtigten SARS-CoV-2 in .)
• Diagnose von Viruserkrankungen
  Infiziert ein Virus aktiv eine Person? Wird die klinische Probe von dieser Person gesammelt, die CPE induziert? Beachten Sie, dass die meisten diagnostischen Methoden (ELISA, RT-qPCR) keine infektiösen Viruspartikel nachweisen.

Abschließend…

Obwohl es mehrere Möglichkeiten gibt, die Virusinfektion zu messen, bleibt die Überprüfung auf CPEs in permissiven Zellen eine weit verbreitete Alternative. Damit es wirklich nützlich ist, müssen Sie die richtige Kombination finden: ein Virus, eine permissive Zelle und eine genaue Anzeige. Sobald Sie diese Kombination gefunden haben, können die Anwendungen sehr vielfältig und nützlich sein, entweder im akademischen Umfeld, in der Industrie oder in der klinischen Diagnostik.

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