Endothel

Das Hornhautendothel bildet die innerste Schicht der Hornhaut und trennt sie vom Kammerwasser in der Vorderkammer des Auges (Abb. 61.1). Das Endothel besteht aus einer einzigen Schicht (ca.4 µm) von Plattenepithelzellen, die durch die deutliche Expression von Ionenpumpen wie Na+/K+/ATPase und Tight Junction Protein wie ZO-1 gekennzeichnet sind (Tabelle 61.1). Diese Schicht dient als Barriere, um den richtigen Dehydratisierungszustand der Hornhaut über einen Pump-Leck-Mechanismus aufrechtzuerhalten .Der Verlust oder die Funktionsstörung der Hornhautendothelzellen (CECs) führt zu einer übermäßigen Flüssigkeitsansammlung in der Hornhaut, was zu fortschreitender Schwellung, Desorganisation des Stromas, verminderter Transparenz und Sehstörungen führt . Die Hauptursachen für Hornhautendothelverlust und -dysfunktion sind Endotheldystrophie, Trauma / Operation oder chronische Uveitis anterior. Fuchs ‚endotheliale Hornhautdystrophie und kongenitale hereditäre Endotheldystrophie gehören zu den häufigsten Hornhautendotheldystrophien, die durch genetische Mutationen und potenzielle Umweltfaktoren verursacht werden . Eine weitere häufige Ursache für Endotheldystrophie, pseudophake bullöse Keratopathie, wird durch Schädigung des Endothels während einer Kataraktoperation induziert. Diabetes und Alterung sind ebenfalls signifikante Risikofaktoren für Hornhautendothelverlust.Im Gegensatz zu Epithelzellen, die sich durch Proliferation reparieren können, haben adulte ZÖK eine begrenzte Proliferationskapazität. Stattdessen neigen Endothelzellen dazu, sich zu reparieren, indem sie in Richtung des Verletzungsbereichs gleiten und benachbarte Zellen vergrößern. Obwohl dieser Mechanismus die Hornhautendothelbarriere nach einer Verletzung aufrechterhält, verringert er auch die Dichte der Endothelzellen und verändert deren hexagonale Morphologie und Pumpkapazität. Wenn die Verringerung der Zelldichte einen Bereich von 500-1000 Zellen / mm2 oder weniger erreicht, ist die einzige verfügbare therapeutische Option eine teilweise oder vollständige Hornhauttransplantation . Derzeit macht die Hornhauttransplantation bei Endothelverlust 60% aller in den USA durchgeführten Hornhauttransplantationen aus .

Um den oben beschriebenen Mangel an Hornhautgewebespendern zu überwinden, konzentrierten sich die ersten Bemühungen auf die Isolierung und ex-vivo-Expansion primärer CECs. Die erste erfolgreiche Kultur menschlicher CECs wurde 1965 berichtet . Seitdem wurden verschiedene Modifikationen in Isolationstechniken, extrazellulären Matrixsubstraten und Kulturmedien entwickelt, um die begrenzte Vermehrungskapazität der Zellen und den Verlust des CEC-Phänotyps in Kultur zu überwinden . Zum Beispiel Okumura et al. untersuchte die Expression verschiedener Laminin-Isoformen in der Hornhaut und identifizierte Laminin-511 und 521 als die vorherrschenden Lamininformen bei erwachsenen DM . Unter Verwendung dieser beiden Laminine als Substrat für die In-vitro-Kultur menschlicher CECs gelang es ihnen, die Anheftung, das Überleben und die Expansion von CECs signifikant zu verbessern . Andere Gruppen haben versucht, menschliche CECs auf menschlichen Spender–abgeleiteten DMs als Substrate zu kultivieren. Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er die In-vivo-Hornhautumgebung nachahmt, um eine ordnungsgemäße CEC-Aufrechterhaltung und ein angemessenes Wachstum zu erreichen . Die Bedeutung von DM bei der Unterstützung der CEC-Expansion wurde auch durch eine kürzlich durchgeführte Studie bestätigt, die in einem Kaninchen-Hornhautendothel-Verletzungsmodell durchgeführt wurde. Dadurch wurde gezeigt, dass das Fehlen von DM die native CEC-Migration und die Hornhautregeneration beeinträchtigte .

Trotz der Vorteile erschwert die Verwendung von Gerüsten die Abgabe in die Hornhaut und erfordert aufwendige chirurgische Eingriffe. Ein viel einfacherer Ansatz wäre die Abgabe von CECs in Zellsuspension. Die Injektion von Zellen in Suspension würde einfachere Herstellungsverfahren ermöglichen und theoretisch weniger invasiv sein . Dieser Ansatz erhöht jedoch das Risiko der Entfernung injizierter Zellen durch den Fluss von Kammerwasser, wodurch das Zellüberleben und die Transplantation in die Hornhaut eingeschränkt werden. Zwei Methoden, die entwickelt wurden, um die Abgabe von Zellsuspensionen in das Hornhautendothel zu verbessern, umfassen die Verwendung einer magnetfeldgeführten Abgabe und die Münzinjektion von Zellen mit einem ROCK-Inhibitor. Für die magnetische Zellabgabe werden CECs mit magnetischen Partikeln markiert und mit Hilfe eines externen Magneten an die entsprechende Stelle auf der hinteren Hornhautoberfläche abgegeben . In einem aktuellen Beispiel wurden CECs mit superparamagnetischen Nanopartikeln markiert und in die vordere Augenkammer von erwachsenen Kaninchen mit CEC-Verletzung injiziert. Ähnlich wie bei nativem CEC bildeten die injizierten Zellen eine Monoschicht und stellten die Hornhauttransparenz ohne nachteilige Auswirkungen wieder her . Alternativ können Okumura et al. verwendete Coinjektion von CECs mit dem ROCK-Inhibitor Y27632, um das Überleben und die Proliferation von CEC zu verbessern. Dieser Ansatz führte zu einer besseren Transplantation der Zellen und einer verbesserten Wiederherstellung der Hornhauttransparenz in einem Kaninchenmodell der Hornhautverletzung . Diese heilsamen Wirkungen wurden in einem Affenmodell der Hornhautendotheldystrophie bestätigt , was zur Einleitung klinischer Studien am Menschen führte. Im Jahr 2018 berichtete dieselbe Gruppe über die Ergebnisse der Transplantation von CECs in Kombination mit einem ROCK-Inhibitor bei 11 Patienten mit bullöser Keratopathie; Mehr als 80% der behandelten Patienten zeigten 24 Wochen nach der Behandlung eine Erholung der Hornhautdicke und eine verbesserte Sehschärfe . Diese Studie lieferte den ersten klinischen Beweis, dass die minimalinvasive Transplantation von kultivierten menschlichen CECs als neue therapeutische Option zur Behandlung von hornhautendothelialen Dysfunktionen eingesetzt werden kann. Gleichzeitig warf es Fragen zur zukünftigen Entwicklung dieses Ansatzes auf. Dazu gehören die Notwendigkeit, eine geeignete Spenderaltersspanne für die Herstellung hochwertiger transplantierbarer CECs zu bestimmen, der mechanistische Beitrag des Inhibitors zu den klinischen Ergebnissen, die genaue Dosierung der Zellen, um Wirksamkeit und Sicherheit auszugleichen, und die Entwicklung eines Mittels zur Verfolgung des Schicksals der gelieferten Zellen nach der Transplantation . Darüber hinaus stellen die begrenzte Verfügbarkeit hochwertiger Spender-CECs und die begrenzte Fähigkeit der Zellen, in vitro zu expandieren, einige erhebliche Herausforderungen für die klinische Translation dieses Ansatzes dar.Aus diesem Grund haben mehrere Gruppen versucht, CEC-ähnliche Zellen aus alternativen Stammzellquellen wie MSCs, Hautzellen, Hornhautstromazellen und PSCs zu erzeugen . In diesen Studien wurde unser aktuelles Verständnis der Embryonalentwicklung von CECs angewendet, indem mutmaßliche CEC-Vorläuferpopulationen wie NCCs aus Primärzellen isoliert und zu reiferen CEC-ähnlichen Zellen differenziert wurden. Beispielsweise wurden Hornhautstromazellen und von der Haut abgeleitete Vorläufer, die NCCs enthielten, isoliert und in Gegenwart von Retinsäure und GSK 3β-Inhibitor (Wnt-Signalwegaktivator) kultiviert, um CEC-ähnliche Zellen zu induzieren. Diese Zellen zeigten eine Hochregulation von Pitx2, einem wichtigen Transkriptionsfaktor für die Entwicklung des vorderen Augensegments, sowie eine Hochregulation der CEC-Marker Atp1a1 und Cdh2. Wichtig ist, dass die Zellen funktionelle Eigenschaften von CECs aufwiesen, wie z. B. die Pumpfunktion. Als die Zellen mit einem Kollagenblatt als Träger transplantiert wurden, stellten sie das Sehvermögen in einem Kaninchenmodell der Keratopathie wieder her . Mit einem ähnlichen Ansatz, Shen et al. differenzierte Haut-abgeleitete Vorläufer durch Kokultur mit B4G12, einer unsterblichen menschlichen CEC-Linie. Innerhalb von 1 Woche nach Differenzierung zeigten die Zellen eine deutliche Expression typischer CEC-Marker. Die Transplantation dieser Zellen führte zur erfolgreichen Wiederherstellung der Hornhautdicke und der Hornhauttransparenz sowohl in Kaninchen- als auch in Affenmodellen der Hornhautendotheldystrophie .

NCCs können auch in vitro aus PSCs erzeugt werden und bieten eine unbegrenzte und erweiterbare Quelle von Zellen für die klinische Anwendung. Zhang et al. berichtete über die Differenzierung humaner ESCs zu periokularen mesenchymalen Vorläuferzellen (POMPs), einem Subtyp von NCCs, durch Transwell-Kokultur mit humanen Hornhautstromazellen. Diese induzierten POMPs wurden in konditionierten Medien aus Linsenepithelzellen kultiviert, und die Differenzierung wurde durch Testen der Genexpression typischer CEC-Marker wie N-Cadherin, FoxC1 und PITX2 bestätigt. Um CEC-ähnliche Zellen anzureichern, wurden die Zellen dann sortiert und auf einer decellularisierten porcinen Hornhautmatrix ausgesät, gefolgt von einer erfolgreichen Transplantation und Induktion der Hornhautreparatur in ein Kaninchenmodell der Hornhautdystrophie .

Um die Verwendung von xenogenem Material aus decellularisierten Hornhäuten zu vermeiden, verwenden neuere Ansätze niedermolekulare Verbindungen und xeno-freie Wachstumsfaktoren, um das CEC-Zellschicksal zu induzieren. Mehrere Gruppen haben beispielsweise eine Differenzierung von PSCs zu NCCs nach der Hemmung des TGFß / SMAD-Signalwegs gezeigt . Diese NCCs wurden dann in Medien kultiviert, die PDGF-BB und Dkk2 enthielten, wodurch die Zellen das hexagonale Erscheinungsbild erhielten und molekulare Marker von CEC-Zellen exprimierten . Wichtig ist, dass die Zellen Kollagen ablagern konnten, das eine in vitro erzeugte DM erzeugt und Hauptkomponenten der hornhautendothelialen Pumpfunktion wie Na + K + ATPasea1 exprimiert . Obwohl vielversprechend, wartet der funktionelle Aspekt dieser PSC-abgeleiteten CEC-ähnlichen Zellen auf weitere Untersuchungen. Einige kritische zukünftige Fragen umfassen die Fähigkeit dieser PSC-abgeleiteten CEC-ähnlichen Zellen, als undichte Barriere zu fungieren und den Dehydratisierungszustand der Hornhaut aufrechtzuerhalten, sowie die Erforschung ihres in vivo therapeutischen Potenzials.