Zusammenfassung
Augentrost, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), ist eine Heilpflanze, die traditionell in Europa zur Behandlung verschiedener Gesundheitsstörungen verwendet wird, insbesondere als Augenwasser zur Behandlung von Augenerkrankungen wie Konjunktivitis und Blepharitis, die mit bakteriellen Infektionen in Verbindung gebracht werden können. Es wurde bereits berichtet, dass einige Euphrasia-Arten ätherisches Öl enthalten. Die Zusammensetzung und Bioaktivität von E. rostkoviana-Öl sind jedoch unbekannt. Daher untersuchten wir in dieser Studie die chemische Zusammensetzung und antimikrobielle Aktivität des ätherischen Augentrostöls gegen einige mit Augeninfektionen assoziierte Organismen: Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Pseudomonas aeruginosa und Candida albicans. Die GC-MS-Analyse ergab mehr als 70 Bestandteile, wobei n-Hexadecansäure (18,47%) der Hauptbestandteil war, gefolgt von Thymol (7,97%), Myristinsäure (4,71%), Linalool (4,65%) und Anethol (4,09%). Das ätherische Öl zeigte eine antimikrobielle Wirkung gegen alle getesteten Organismen mit Ausnahme von P. aeruginosa. Die beste Aktivität wurde gegen alle getesteten grampositiven Bakterien mit minimalen Hemmkonzentrationen von 512 µg / ml beobachtet. Dies ist der erste Bericht über die chemische Zusammensetzung des ätherischen Öls von E. rostkoviana und seine antimikrobielle Aktivität.
1. Einleitung
Augentrost, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), wird in Europa seit Jahrhunderten als traditionelle Medizin zur Behandlung verschiedener Krankheiten eingesetzt. Abkochungen und Infusionen von blühenden Luftteilen werden gegen trockenen Husten, Heiserkeit, symptomatische Behandlung von Erkältung, Ohrenschmerzen und Kopfschmerzen, Heuschnupfen, eitrigen Hautläsionen oder katarrhalischen Erkrankungen des Darmtrakts, insbesondere aber als Augenwasser zur Behandlung und Vorbeugung von Augenerkrankungen wie Konjunktivitis, Blepharitis, Augenermüdung, eitrigen Augenentzündungen und Sties eingesetzt . Die Verwendung von Augentrosttee wurde auch in der Ethnoveterinärmedizin zur Behandlung von Kuhaugeninfektionen berichtet . Trotz jahrhundertelanger traditioneller Anwendung zur Behandlung von Augenerkrankungen wurde nur eine prospektive Kohortenstudie durchgeführt, in der die Wirksamkeit von Euphrasia-Augentropfen bei der Behandlung von Konjunktivitis bestätigt wurde, und eine einzige klinische Studie untersuchte die Wirkung der lokalen Anwendung der Augentropfen auf den Antibiotikakonsum bei Neugeborenen . Darüber hinaus war bis zu den jüngsten Berichten über die antikandidale und antibakterielle Aktivität einiger Euphrasia-Extrakte das Spektrum der antimikrobiellen Wirkung völlig unbekannt.
Die therapeutische Wirkung von E. rostkoviana kann hauptsächlich auf seine antioxidative, entzündungshemmende und antimikrobielle Aktivität zurückgeführt werden . Unter den Verbindungen, die zuvor in E. rostkoviana-Extrakten identifiziert wurden , können Apigenin, Luteolin, Kaempferol, Quercetin, Kaffeesäure, Cumarsäure und Rosmarinsäure für die antimikrobielle Wirkung verantwortlich sein. Obwohl das Vorhandensein von ätherischem Öl (EO) in E. officinalis L. und E. stricta Kunt wurde zuvor berichtet, Die Zusammensetzung und Bioaktivität des E. rostkoviana EO sind unbekannt. Daher untersuchten wir in dieser Studie die chemische Zusammensetzung und antimikrobielle Aktivität des Eyebright EO gegen das Panel von drei grampositiven Bakterien (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus und S. epidermidis) und drei gramnegativen Bakterien (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae und Pseudomonas aeruginosa) und einer Hefe (Candida albicans), Organismen, die häufig mit Augeninfektionen assoziiert sind.
2. Material und Methoden
2.1. Chemikalien und Pflanzenmaterial
Die authentischen Standards Borneol, Kampfer, Carvacrol, Carvon, Caryophyllen, p-Cymol, Estragol, Eukalyptol, Limonen, Linalool, Menthol, Menthon, β-Myrcen, γ-Terpinen und Thymol zur Identifizierung von EO-Komponenten sowie die Kontrollantibiotika Ciprofloxacin und Tioconazol wurden von Sigma-Aldrich (Prag, Tschechische Republik) bezogen. Als Lösungsmittel wurden Hexan (Merck, Prag, Tschechische Republik), Dimethylsulfoxid (DMSO) (Lach-Ner, Neratovice, Tschechische Republik) und Tween 80 (Sigma-Aldrich, Prag, Tschechische Republik) verwendet. Das für die EO-Destillation verwendete Pflanzenmaterial wurde aus kommerziellen Quellen (F-DENTAL, Hodonín, Tschechische Republik) bezogen. Das EO wurde durch Hydrodestillation mit Clevenger-Apparaten extrahiert.
2.2. Chemische Analyse der EO durch Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)
Die EO von E. rostkoviana wurde mittels GC-MS unter Verwendung von Agilent 7890A GC in Verbindung mit einem Agilent 5975C Single-Quadrupol-Massendetektor analysiert, der mit einer HP-5MS-Säule (30 m × 0,25 mm, 0,25 µm Film) von Agilent (Santa Clara, CA, USA) ausgestattet war. Hexan wurde als Lösungsmittel verwendet und das Probenvolumen von 1 µL im Split-Modus (Verhältnis 20: 1) in den auf 250 °C erhitzten Injektor injiziert. Die Startofentemperatur wurde für 3 min auf 60 °C eingestellt, mit einer Geschwindigkeit von 3 ° C/min auf 230 ° C programmiert und dann für 10 min konstant gehalten. Als Trägergas wurde Helium mit der Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min verwendet. Die MS-Analyse wurde im Full-Scan-Modus durchgeführt und die Elektronenionisationsenergie auf 70 eV eingestellt. Die Identifizierung einzelner Komponenten basierte auf dem Vergleich ihrer Massenspektren und relativen Retentionsindizes mit der National Institute of Standards and Technology Library (NIST, USA) und Literatur sowie der Prägung authentischer Standards.
2.3. Bakterienstämme und Kultivierungsmedien
Die Standardstämme der drei grampositiven Bakterien Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213 und S. epidermidis ATCC 12228, drei gramnegative Bakterien Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 und Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 und eine Hefe Candida albicans ATCC 10231 wurden von Oxoid (Basingstoke, Vereinigtes Königreich) erhalten. Kationenbereinigte Mueller-Hinton-Brühe (MHB) und Sabouraud-Dextrose-Brühe (SDB) wurden als Kultivierungsmedien für antibakterielle bzw. antimykotische Mikrodilutionstests verwendet und mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (Sigma-Aldrich, Prag, Tschechische Republik) äquilibriert. Mueller-Hinton-Agar (MHA) und Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA) wurden für die nachfolgende Bestimmung der bakteriziden bzw. fungiziden Konzentrationen verwendet. Alle Medien wurden von Oxoid (Basingstoke, Vereinigtes Königreich) gekauft.
2.4. Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK)
Die MHK wurden unter Verwendung der In-vitro-Bouillon-Mikrodilutionsmethode gemäß den Richtlinien des Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) bestimmt, die gemäß den Empfehlungen zur wirksamen Beurteilung des antiinfektiösen Potenzials von Naturprodukten unter Verwendung von 96-Well-Mikrotiterplatten modifiziert wurden. Kurzzeitig wurde das EO in DMSO unter Zugabe von Tween 80 gelöst und zweifache serielle Verdünnungen in MHB für Bakterien und in SDB für die Hefe hergestellt, wobei die getesteten Konzentrationen im Bereich von 4 bis 2048 µg/ml lagen. Das Inokulum wurde aus Nachtkulturen hergestellt, so dass die anfänglichen KBE-Konzentrationen in den Mikroplatten 5 × 105 bzw. 2 × 103 KBE/ml für Bakterien und Hefe betrugen. Die inokulierten Platten wurden nach 24 h Inkubation bei 35°C und nochmals nach 48 h auf C. albicans untersucht. Das mikrobielle Wachstum wurde spektrophotometrisch mittels Multiscan Ascent Microplate Photometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) bei 405 nm gemessen. MICs wurden als die niedrigsten Konzentrationen ausgedrückt, die in der Lage waren, ≥ 80% des Bakterienwachstums im Vergleich zur positiven Wachstumskontrolle zu hemmen. Die Experimente wurden in drei unabhängigen Tests in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und Medianwerte wurden für die MICs-Berechnung verwendet. Aufgrund der kürzlich berichteten Möglichkeit des Einflusses flüchtiger EO-Komponenten auf das mikrobielle Wachstum in angrenzenden Bohrlöchern wurden positive Wachstumskontrollreihen zwischen die EO-Verdünnungsreihen eingefügt, um einen eventuellen Wachstumseinfluss festzustellen. Die verwendeten Lösungsmittel hemmten das Bakterienwachstum in den getesteten Konzentrationen nicht. Ciprofloxacin und Ketoconazol wurden als Referenzantibiotika für Bakterien bzw.
2.5. Bestimmung der minimalen bakteriziden Konzentration (MBC) und der minimalen fungiziden Konzentration (MFC)
Die Aliquots von 20 µL wurden aus jeder Vertiefung ohne mikrobielles Wachstum auf die MHA-Platten (SDA-Platten für C. albicans) nach 24 h bzw. 48 h Inkubation von Bakterien und Hefen getestet. Die Platten wurden dann für 24 h bei 35 ° C inkubiert. Die MBC und MFC wurden als ≥ 99,9% ige Abnahme der KBE im Vergleich zum Inokulum bewertet, die alle in drei unabhängigen Tests in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden.
3. Ergebnisse und Diskussion
3.1. Chemische Charakterisierung von Ölen und Bestandteilen bioaktiver Fraktionen
Die EO-Hydrodestillation mit Clevenger-Apparaten ergab 0,02% (w/ v) gelblich-braunes Öl, das bei Raumtemperatur zur Verfestigung neigt, was wahrscheinlich auf einen hohen Anteil an Fettsäuren zurückzuführen ist (insgesamt 32,23%). Die GC-MS-Analyse des EO ergab das Vorhandensein von mehr als 70 Bestandteilen, wobei Palmitinsäure (18,47%) die am häufigsten vorkommende Komponente war, gefolgt von Thymol (7,97%), Myristinsäure (4,71%), Linalool (4,65%), Anethol (4,09%), Linolensäure (3,81%), Hexahydrofarnesylaceton (3,16%), Laurinsäure (2.79%), α-terpineol (2.39%), and borneol (2.39%). The main compounds are shown also in the chromatogram (Figure 1) and the complete list of EO constituents is presented in Table 1.
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| R: retention indices relative to n-alkanes on HP-5MS capillary column (30 m × 0.25 mm, 0.25 m); peak area relative to total peak area in %; ID: identification method; a: identification based on mass spectra matching; b: identification based on retention index; c: identifizierung basierend auf Münzeinwurf einer authentischen Probe; d: vorläufige Identifizierung. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Der hohe Gehalt an Fettsäuren wurde bisher im E. stricta EO (insgesamt 25,7%) auch mit dem höchsten Anteil an Palmitinsäure (20,3%) und Myristinsäure (3,9%) gefunden . Es ist jedoch keine andere Verbindung in signifikanter Menge vorhanden, die auf die Verwandtschaft dieser beiden Euphrasia-Arten hindeuten würde.
3.2. Antimikrobielle Aktivität
Die E. rostkoviana EO zeigte Aktivität gegen sechs von sieben getesteten Organismen mit MHS im Bereich von 512 bis 2048 µg / ml. Die grampositiven Bakterien waren empfindlicher als die gramnegativen und die Hefe, während P. aeruginosa der einzige Organismus war, der in den höchsten getesteten Konzentrationen nicht durch das Öl gehemmt wurde. Die MICs, MBCs und MFCs der EO gegen alle getesteten Mikroorganismen sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Die Wirkstoffkonzentrationen sind vergleichbar mit denen, die zuvor beispielsweise für EOS von Artemisia annua, Eucalyptus globulus, Mentha suaveolens, Myrtus communis, Ocimum basilicum oder Thymus vulgaris berichtet wurden, insbesondere im Fall von antikandidaler Aktivität . Das Öl war auch wirksamer als E. rostkoviana-Extrakte, die von Teixeira und Silva gegen E. coli, E. faecalis, S. aureus und S. epidermidis getestet wurden. Die MICs der Referenzantibiotika gegen die Bakterien und Hefen, die für das E anfällig sind. rostkoviana EO waren in Übereinstimmung mit den CLSI akzeptablen Grenzwerten und früheren Berichten.
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| The growth inhibition was measured after 24 h and 48 h of incubation in case of C. albicans; EO: essential oil; CIP: ciprofloxacin; TIO: tioconazole; MIC: minimum inhibitory concentration; IC50: inhibitory concentration causing ≥50% of bacterial growth; MBC: minimum bactericidal concentration; MFC: minimum fungicidal concentration. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Da der Gehalt des EO-Hauptbestandteils Palmitinsäure 20% nicht überschreitet und es mehr als 10 andere antimikrobiell wirksame Verbindungen im Bereich von 1 bis 8% gibt, ist es schwierig, die Hauptwirkstoffe vorzuschlagen, die für die E. rostkoviana EO verantwortlich sind antimikrobielle Wirkung. Palmitinsäure wurde zuvor als Hauptverbindung von Fraktionen identifiziert, die gegen gramnegative, aber nicht grampositive Bakterien wirksam sind . Andererseits ist bekannt, dass mittelkettige gesättigte Fettsäuren und langkettige ungesättigte Fettsäuren insbesondere grampositive Bakterien hemmen . Darüber hinaus übt Laurinsäure auch Aktivität gegen eine Reihe von Pilzen aus . Somit ist die antimikrobielle Aktivität des EO wahrscheinlich auf eine komplexe Wirkung der antimikrobiellen Fettsäuren mit den anderen bekannten antimikrobiellen Verbindungen zurückzuführen, die im EO identifiziert wurden, wie Anethol, Borneol, Kampfer, Carvacrol, Linalool, Menthol, α-Terpineol oder Thymol.
4. Schlussfolgerungen
Abschließend ergab die chemische Analyse eine Reihe von antimikrobiell aktiven Substanzen, die in der E. rostkoviana EO und seine antimykotische und antibakterielle Aktivität gegen grampositive sowie gramnegative Bakterien wurden bestätigt. Nach unserem besten Wissen ist dies der erste Bericht über die Zusammensetzung und antimikrobielle Aktivität von E. rostkoviana EO.
Interessenkonflikt
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt bezüglich der Veröffentlichung dieses Artikels besteht.
Danksagung
Diese Arbeit wurde von der Europäischen Wissenschaftsstiftung und dem Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik Project CZ finanziell unterstützt.1.07/2.3.00/30.0040; durch den S-Grant des Ministeriums für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik; und von der Tschechischen Universität für Lebenswissenschaften Prag Projekt IGA 20155012. Die Autoren danken Slavka Barlakova für das englische Korrekturlesen.