HNSCC positivo y negativo para VPH/p16 Muestra diferencias en el compromiso ganglionar
Determinamos el estado de VPH y p16 de 241 pacientes con carcinoma de células escamosas orofaríngeo (OPC) tratados con RT de radiación (quimioterapia) (c). Las muestras de tumores humanos se adquirieron de acuerdo con protocolos aprobados por el Consejo Ético de los Hospitales Universitarios de Lovaina (Lovaina, Bélgica) y se obtuvo el consentimiento implícito de todos los pacientes. Los datos clinicopatológicos se extrajeron de las historias clínicas de los pacientes y el tiempo medio de seguimiento fue de 4,19 años. Los pacientes con VPH positivo se caracterizaron por estadios T más bajos, con un 45% (26 de 58; p = 0,025) de los pacientes con VPH positivo que mostraron tumores en estadios T1/2, mientras que este fue del 29% (51 de 175; p = 0,025) en el grupo con VPH negativo. Además, los tumores positivos al VPH mostraron significativamente más altos (p = 0.014) compromiso ganglionar con 72% (42 de 58) de los pacientes con VPH positivo que mostraron tumores N2/N3, mientras que esto fue solo 54% (95 de 175) en el grupo con VPH negativo. Aunque la relación entre el estado de p16 y el estadio N no fue significativa, se observó una tendencia a mayor compromiso ganglionar y positividad de p16. Sesenta y tres% de los pacientes positivos a p16 mostraron tumores N2/N3, mientras que en el grupo negativo a p16 solo el 54% (Tabla 1). Estos resultados están en concordancia con otros estudios, que muestran que los pacientes HNSCC positivos al VPH tienen estadios N y T más altos.
Según lo previsto, los estadios T bajos dieron lugar a mejores tasas de control a distancia (DC) con tasas de control a 5 años de 83% y 70% (p = 0,04) para T1/Tumores T2 y T3/4 respectivamente (Archivo adicional 1: Figura S1A). Los tumores N2 / 3 (DC a 5 años 70%; p = 0,02) mostraron un riesgo más alto de fracaso a distancia en comparación con los tumores N0/1 (tasa de DC a 5 años 85%; p = 0,02) (Archivo adicional 1: Figura S1B). No se observó diferencia estadísticamente significativa en la tasa de DC entre enfermedad positiva y negativa para VPH (tasa de DC a 5 años de 82% vs tasa de DC a 5 años de 72% respectivamente; p = 0,20) (Archivo adicional 1: Figura S1C). Aunque no es significativa, esta diferencia de 10% en las tasas de DC indica influencia del virus más allá del control tumoral local. Además, indica la presencia de diferentes patrones de diseminación entre HNSCC positivo y negativo para VPH.
p16 reprime la capacidad de invasión y migración de las células HNSCC positivas para VPH
Para investigar el mecanismo molecular detrás de estas posibles diferencias observadas en la metástasis en nuestra cohorte de pacientes, evaluamos la capacidad de migración e invasión in vitro de las células HNSCC. Las células SCC154 y SCC104 positivas para VPH/p16 mostraron una tasa de migración significativamente menor en comparación con las células SQD9, CAL27 y SC263 negativas para VPH/p16 (Fig. 1a). De acuerdo con el ensayo de migración, las células positivas al VPH/p16 mostraron capacidades de invasión reducidas en comparación con las células negativas al VPH/p16 (Fig. 1b).
p16 represses the in vitro invasion and migration capacity of HPV positive HNSCC. a Migration capacity of HPV negative cells (SQD9, CAL27 and SC263) and HPV positive cells (SCC154, SCC104). b Invasion capacity of HPV negative SQD9 cells and HPV positive SCC154 cells. c Migration capacity of HPV positive SCC154 cells treated with shRNA for p16 (shp16) and control (shluc). d Capacidad de invasión de células SCC154 positivas para VPH tratadas con ARSR para p16 (shp16) y control (shluc). (a-d) El resultado se muestra como media ± SEM de tres experimentos y los valores de p se calculan mediante la prueba t bilateral
El supresor tumoral p16 es un regulador del ciclo celular bien conocido y un buen marcador sustituto para HNSCC positivo para VPH . Además, datos recientes atribuyen un papel más amplio a p16, incluido un papel en la migración y la represión de la angiogénesis . Por lo tanto, también examinamos la influencia de p16 en la capacidad de migración e invasión de células SCC154 positivas para VPH manipuladas con ARN de horquilla corta (shRNA) para p16 (shp16) y shRNA de control (shluc). La regulación a la baja de la expresión de p16 aumentó las capacidades de migración e invasión de las células SCC154 (Fig. 1c y d). Estos datos verifican la presencia de diferencias en los patrones de diseminación entre HNSCC positivo y negativo para VPH y sugieren un papel activo de p16 en la cascada metastásica.
p16 suprime la migración y la invasión a través de la angiogénesis en CPHN positivo para VPH
Es bien sabido que la angiogénesis, que se mantiene activamente en las células cancerosas mediante factores proangiogénicos, como el factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGFA), es un conducto para la diseminación y metástasis de las células cancerosas y promueve una progresión tumoral agresiva . Además, la correlación negativa entre VPH/p16 y VEGFA se describió previamente en HNSCC . Por lo tanto, evaluamos la relación entre VPH, p16 y VEGFA en nuestra cohorte de pacientes. Los pacientes con VPH positivo mostraron una expresión de VEGFA significativamente menor, con un 54% (28 de 51) de los pacientes sin expresión de VEGFA o con una expresión baja en comparación con el 32% (53 de 161) en el grupo con VPH negativo (Tabla 2). Aunque la correlación negativa entre VEGFA y p16 fue menos pronunciada, se observó una tendencia a la significación (Tabla 2).
Investigamos más a fondo la relación entre la angiogénesis y p16 con xenoinjertos in vivo inyectados con células SCC154 VPH positivas manipuladas con shp16 o shluc. Se detectó un mayor número de vasos sanguíneos en tumores de ratones con baja expresión de p16 en comparación con los tumores de control (Fig. 2a). Además, el aumento de la vascularización dio como resultado una menor necrosis, un mayor número de células mitóticas y una ventaja de crecimiento de los tumores que expresan shp16 (Archivo adicional 2: Figura S2A-C). No se pudo verificar la implicación de p16 en la supresión de metástasis in vivo debido a la ausencia de un modelo animal metastásico. Sin embargo, la ventaja de crecimiento y el aumento de la vascularización observados en tumores de ratones shp16 pueden explicar la frecuente aparición de estadios T avanzados en pacientes con CCHNP negativos para VPH.
Doble función de p16 en la diseminación de HNSCC. formación de vasos sanguíneos en modelos de xenoinjerto de ratón SCC154 shp16 y SCC154 shluc evaluados mediante tinción de CD31( arriba del gráfico); n = 5. b Número promedio de formación de vasos linfáticos en modelos de ratón xenoinjerto SCC154 shp16 y SCC154 shluc evaluados mediante tinción de LYVE-1 (arriba del gráfico); n = 5. c Puntuación media de tinción de integrina alfa4 beta1 en modelos de xenoinjerto de ratón SCC154 shp16 y SCC154 shluc; n = 5. d Average score of alpha4 beta1 integrin staining in HPV positive SCC154 (n = 7) and HPV negative SQD9 (n = 10) mouse xenograft models. los valores de P a-d se calculan mediante una prueba t bilateral
p16 estimula la linfangiogénesis y la diseminación ganglionar en pacientes HNSCC positivos para VPH
Estos resultados aún no explican la aparición de tasas similares de recaída a distancia en pacientes HNSCC positivos para VPH/p16 y negativos y ciertamente no explican la asociación altamente significativa entre la positividad para VPH y compromiso ganglionar descrito en nuestro estudio y en varios otros . Esto es especialmente importante, ya que implica la presencia de un alto potencial metastásico local en las células HNSCC positivas para VPH. Curiosamente, la linfangiogénesis, al igual que la angiogénesis, promueve la metástasis tumoral al inducir el crecimiento de nuevos vasos linfáticos dentro del tumor y aumentar el tráfico de células a los ganglios linfáticos. Además, el aumento de la densidad de los vasos linfáticos en los tumores se relaciona con un aumento de la metástasis a los ganglios linfáticos. . Por lo tanto, evaluamos la formación de vasos linfáticos por inmunotinción de hialuronan de vasos linfáticos homólogos (LYVE-1) en tumores de ratones shluc y shp16. Encontramos que la supresión de p16 dio lugar a una menor densidad de vasos linfáticos en xenoinjertos positivos para VPH/p16, lo que sugiere una doble función de p16 en la metástasis (Fig. 2b).
Para entender la función de la p16, nos centramos en las integrinas, ya que estas proteínas son aceptadas como reguladores clave de la angiogénesis y la linfangiogénesis . Además, la unión de p16 a las integrinas y la pérdida de propagación celular están documentadas previamente . Integrinas como alfa4 beta1 son importantes moduladores de la linfangiogénesis . Por lo tanto, evaluamos la presencia de integrina alfa4 beta1 en tumores de ratones SCC154 shluc y SCC154 shp16. Although not statistically significant (p = 0.09), shluc tumors showed a higher percentage of integrin compared to shp16 tumors (Fig. 2c). In line with SCC154 shRNA xenografts, tumors from HPV/p16 positive SCC154 xenografts showed higher percentage of alpha4 beta 1 integrin compared to tumors from HPV/p16 negative SQD9 xenografts (Fig. 2d).