Los bacteriófagos, también llamados fagos, son virus que infectan específicamente a las bacterias y podemos confirmar su presencia y cuantificarlos utilizando una herramienta llamada ensayo de placa. Los bacteriófagos infectan a sus huéspedes susceptibles uniéndose primero a la pared celular bacteriana e inyectando su material genético. Luego, secuestran la maquinaria biosintética de la célula para replicar su ADN y producir numerosas partículas de fagos de progenie, que luego liberan al lisar y matar a la célula huésped.

Esta actividad lítica es la base de una técnica de enumeración de fagos ampliamente utilizada conocida como ensayo de placa o ensayo de doble capa de agar. Aquí, una mezcla de bacteriófagos se prepara primero en un caldo de nutrientes fundidos que contiene agar de baja concentración. Todas las bacterias utilizadas en la mezcla deben estar vivas y dividirse activamente en la fase logarítmica de su crecimiento, lo que asegurará que un gran porcentaje de las bacterias sean viables y capaces de formar un césped denso alrededor de las placas. A continuación, esta mezcla de agar fago bacteriano fundido se extiende sobre un medio nutritivo de agar concentrado más sólido que ya está solidificado en una placa de Petri. En la incubación a temperatura ambiente, el caldo de agar-fago-bacterias de baja concentración también se solidifica para formar una capa de agar suave.

Aquí, las células bacterianas pueden derivar nutrientes adicionales de la capa inferior y deben multiplicarse rápidamente para producir un césped confluente de bacterias. Sin embargo, como las partículas de fagos también están presentes en la capa blanda, estas infectarán y replicarán su material genético dentro de las bacterias, culminando en lisis celular, que libera múltiples progenies. Estas progenie de fagos luego infectan a las células vecinas, ya que el estado semisólido de la capa de fagos bacterianos restringe su movimiento a las células huésped más distantes. Este ciclo de infección y lisis continúa en múltiples rondas, matando a un gran número de bacterias en un área localizada. El efecto de la destrucción de las células vecinas es producir una única zona circular clara, llamada placa, que se puede ver a simple vista, amplificando efectivamente la actividad bacteriana lítica del fago y permitiendo su enumeración.

El número de placas en una placa de Petri se conoce como Unidades Formadoras de placa, o PFUs, y, siempre que la concentración inicial de bacteriófagos esté suficientemente diluida, debe corresponder directamente al número de partículas de fagos infecciosos en la muestra original. Esta técnica también se puede utilizar para la caracterización de la morfología de la placa, para ayudar en la identificación de tipos de fagos o para aislar mutantes de fagos. En este laboratorio, aprenderá a realizar el ensayo de placa para enumerar fagos, utilizando el fago T7 de E. coli como ejemplo.

En primer lugar, identificar un medio adecuado para el cultivo de las células bacterianas huésped y el bacteriófago. Aquí se utilizó caldo de lisogenia, o medio LB, para cultivar E. coli y el fago T7. A continuación, tome tres botellas de vidrio limpias y etiquételas con medios, nombre, y luego la primera como Caldo de LB, la segunda como Agar de Fondo de LB y la tercera como Agar de Tapa de LB. Ahora, pese cuatro gramos de polvo pre-formulado de LB en tres juegos y luego transfiera un juego de medios secos pesados a cada botella. Agregue 200 mililitros de agua a la primera botella. Mezcle el contenido con una barra de agitación magnética.

Luego, usando un medidor de pH y agitación constante, lleve el pH final a 7,4 mediante la adición de hidróxido de sodio o ácido clorhídrico. Repita también la adición de agua y el ajuste de pH para las otras dos botellas restantes. Ahora, pesa tres gramos de polvo de agar y agrégalo a la segunda botella para hacer un agar inferior al 1,5%. Finalmente, pesa 1. 2 gramos de agar y añadirlo a la tercera botella para hacer el .6% LB de agar superior. La condición de caldo en botella uno no necesita una adición de agar. Tape la botella semi herméticamente y luego esterilice el medio esterilizando en autoclave a 121 grados centígrados durante 20 minutos. Una vez que esté completo, retire las botellas de medios del autoclave y gire inmediatamente las tapas de las botellas para cerrarlas completamente y evitar la contaminación. Mantenga los medios de Agar LB-Caldo y LB-Top en el banco para su uso posterior. Coloque el Agar de fondo LB para enfriar en un baño de agua que esté preestablecido a aproximadamente 45 grados Celsius.

Cuando el agar inferior LB alcance aproximadamente 45 grados Celsius, transfiéralo al banco de trabajo. A continuación, esterilice el espacio de trabajo con un 70% de etenol. A continuación, agregue 450 microlitros de cloruro de calcio molar estéril al agar de fondo fundido para obtener una concentración final de 2.25 milímetros. Agitar suavemente el frasco para mezclar. Luego, prepara siete placas de Petri limpias. Etiqueta cada plato en la parte inferior con el nombre del medio y la fecha de preparación. Luego, vierte 15 mililitros del agar inferior en cada una de las siete placas de Petri. Deje que los platos se fijen durante unas horas o durante la noche a temperatura ambiente. Una vez establecidas, las placas de cultivo se pueden almacenar a cuatro grados centígrados durante varios días, si es necesario, boca abajo para minimizar la condensación. Transfiera las placas de Petri del refrigerador de cuatro grados centígrados a una incubadora de 37 grados centígrados una hora antes del ensayo.

El día anterior a la realización del ensayo, se debe cultivar la E. coli. Aquí, se inocularon 10 microlitros de cultivo de E. coli en 10 mililitros de caldo LB. Coloque las bacterias para que crezcan durante la noche en una incubadora agitadora a 37 grados centígrados a 160 RPM. Luego, el día del ensayo, retire el cultivo bacteriano de la incubadora. Siembra 10 mililitros frescos de caldo de libras frescas con 0,5 mililitros de la cultura nocturna. Coloque estas células para que crezcan en una incubadora agitadora a 37 grados centígrados a 160 RPM. A continuación, utilice un espectrofotómetro para comprobar cuándo este cultivo alcanza el crecimiento en fase logarítmica, indicado por una densidad óptica de 0,5 a 0,7. Una vez que la DO alcance este nivel, detenga la incubación transfiriendo el cultivo celular al banco. Ahora están listos para ser utilizados para el ensayo de superposición de fagos.

Los títulos de fagos pueden variar exponencialmente entre diferentes tipos de fagos y muestras. Por lo tanto, para contarlos de manera efectiva, deben diluirse para generar una amplia gama de concentraciones de fagos. El día del ensayo, genere una serie de diluciones de fagos que oscilen entre una décima y una millonésima concentración, siguiendo una técnica de dilución de 10 veces. Para obtener datos estadísticamente significativos y precisos, realice la dilución en serie por triplicado.

A continuación, derretir el agar solidificado con tapa de LB usando un microondas. Luego, colóquelo en un baño de agua que esté preestablecido a 45 grados centígrados durante una hora. Después de una hora, recoge las placas de Petri que contienen la capa de agar inferior de la incubadora. Etiquete las placas con la concentración de fagos y la fecha de ensayo. Luego, coloque siete tubos de ensayo limpios. Etiquete cada tubo de ensayo con el número de dilución de fagos en serie y designe uno como control.

Cuando el agar LB-top alcance los 45 grados Celsius, transfiéralo al banco de trabajo. Ahora, agregue 450 microlitros de cloruro de calcio molar al agar de 200 mililitros para obtener una concentración final de 2,25 milimolares. Agitar suavemente el frasco para mezclar. A continuación, agregue 35 mililitros de agar LB-top y cuatro mililitros de suspensión bacteriana a un tubo cónico estéril. Agitar suavemente para distribuir uniformemente las células, pero evitar agitar para evitar la formación de espuma.

Ahora, alícuota cinco mililitros de esta mezcla de agar superior bacteriano en cada uno de los siete tubos de ensayo. Luego, transfiera 100 microlitros de muestras de bacteriófagos diluidos en serie y medios de control, que deben ser simplemente medios sin bacteriófagos, a los tubos de ensayo respetuosamente etiquetados. Agitar la mezcla suavemente para asegurar una mezcla adecuada. Transfiera suavemente cinco mililitros de mezcla de bacteriófagos a la placa de Petri correspondiente. Distribuya uniformemente la mezcla por toda la superficie girando suavemente la placa de Petri.

Una vez que todas las placas de Petri estén en capas con la mezcla, permita la solidificación de la capa superior incubándola a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de completar estos pasos, repita el proceso para el segundo y luego el tercer juego de placas de Petri utilizando los dos juegos restantes de diluciones de fagos. Selle cada plato con parafilm e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Coloque la placa de cultivo boca abajo a una temperatura adecuada durante 24 horas o hasta que se formen placas. Aquí, las placas se colocaron en una incubadora de 37 grados centígrados durante un día, una condición de crecimiento estimulante para E. coli y el fago T7.

Las placas aparecerán después de uno a cinco días de incubación, dependiendo de la especie bacteriana, las condiciones de incubación y la elección del medio. Aquí, las placas eran visibles después de un día de incubación a 37 grados Celsius. Comience comprobando las placas de control marcadas y asegúrese de que no se hayan formado placas en estas placas, ya que esto indicaría contaminación viral. Para determinar el título de fago en la muestra original, comience primero con las placas que contienen la muestra de fago más diluida y cuente las placas sin quitar las tapas, marcándolas para indicar cuáles ya se han contado. Repita el conteo para cada plato en cada juego. Algunas placas pueden tener demasiadas o muy pocas placas para ser contadas. Considere de 10 a 150 como un recuento ideal de placas.

A continuación, genere una tabla con los valores de los números de placa para las diferentes diluciones y réplicas. A continuación, calcule los valores medios del número de placa para las placas de dilución que contenían el número ideal de recuentos de placa. En este ejemplo, estas fueron el número promedio de placas formadas en las placas de dilución de 10 a menos tres y de 10 a menos cuatro. Ahora, ajuste el factor de dilución de fagos dividiendo los valores medios de placa obtenidos por los factores de dilución de fagos respectivos. En este caso, el número medio de placas formadas a las placas de dilución de 10 a menos tres y de 10 a menos cuatro, se dividió por sus respectivos factores de dilución para obtener el número de unidades formadoras de placa, o PFUs, en 100 microlitros de mezcla de fagos. Para convertir el valor a UFP por mililitro, multiplicar los valores generados por 10, ya que solo se utilizaron 100 microlitros de mezcla de dilución de fagos durante la etapa de preparación de recubrimiento de bacteriófagos, produciendo un factor de dilución adicional de 10. Finalmente, calcular la media de los valores obtenidos de las diferentes placas de dilución. Esto dará el número promedio de PFUs por mililitro. El número de PFUs corresponde al número de partículas de fagos infecciosos de la muestra original.