Al igual que con el aislamiento de ADN, los científicos comúnmente confían en los kits de aislamiento de ARN para hacer su vida más fácil. Recientemente, publicamos un blog sobre purificación de ADN sin un kit que describe varias razones por las que hacer algo sin un kit tiene ventajas: menos desperdicio de plástico, menos gasto y menos de quedarse con un montón de soluciones aleatorias cuando se agotan todas las columnas giratorias. En este artículo, cubrimos los conceptos básicos del aislamiento de ARN sin un kit.

Consejos para trabajar con ARN (ya sea que esté usando un kit o no)

Aunque no hace falta decir que uno debe tener cuidado cuando se realiza cualquier tipo de purificación de ADN o ARN para evitar la contaminación, tenga un cuidado adicional al realizar la extracción de ARN. El ARN no es inherentemente tan estable como el ADN, es de cadena simple y sus grupos de ribosa son susceptibles a la hidrólisis y la degradación del calor. Además, las RNasas, o enzimas que degradan el ARN, son proteínas especialmente resistentes que se encuentran en y sobre todo, incluida la piel. Estos son algunos consejos generales para trabajar con ARN, incluso si está utilizando un kit:

• Siempre use guantes, ya que las RNasas en sus manos pueden degradar el ARN.
• Mantenga un área de trabajo limpia, lo que puede incluir rociar su banco con un producto para eliminar las RNasas, como RNaseZAP.
• Al cosechar tejidos, células, plantas, hongos o bacterias, mantenga las muestras frías y trabaje rápidamente para mitigar la degradación del ARN.
• Asegúrese de utilizar agua tratada con DEPC o sin RNasa. Si usa agua tratada con DEPC, autoclave el agua para inactivar el DEPC.
• Asegúrese de que los artículos de plástico o vidrio utilizados no contengan RNasa. Los artículos de plástico libres de RNasa están fácilmente disponibles en proveedores científicos y los artículos de vidrio deben tratarse con una solución DEPC durante 1 hora y esterilizarse en autoclave para eliminar los residuos de DEPC. Alternativamente, la cristalería se puede hornear a 180°C durante al menos 4 horas.
• Si las muestras finales de ARN se resuspenden en agua o tampón TE, guárdelas en un congelador de -80°C para evitar la degradación del ARN. Se degradarán en un congelador de -20 ° C.

Los métodos de extracción de ARN evolucionaron en un protocolo simple que todavía se usa hoy en día

Hay muchos métodos alternativos para aislar el ADN sin un kit. Sin embargo, ese no es el caso de la extracción y purificación de ARN. Hay un método simple que funciona, y variaciones a ese método. Un obstáculo importante para el desarrollo de protocolos para aislar el ARN fue que las RNasas se encuentran comúnmente en las células, y sin algo que bloquee la actividad de la RNasa en la lisis celular, el ARN se degrada. Para aislar eficazmente el ARN intacto, se necesitaría un desnaturalizador de proteínas rápido y fuerte, algo que descompusiera las RNasas antes de que las RNasas tuvieran la oportunidad de descomponer el ARN tras la lisis celular.

A finales de la década de 1970, Chirgwin y sus colegas demostraron que un fuerte desnaturalizador de proteínas, el tiocianato de guanidinio, hacía precisamente esto (Chirgwin et al., 1979). Desarrollaron un protocolo destinado a aislar ARN de bazos de rata en el que homogeneizaban bazos en una solución de tiocianato de guanidinio y hilaban el homogeneizado para eliminar el material insoluble. Luego, el homogeneizado se cargó en gradientes de cloruro de cesio y se ultracentrifugó durante 20 horas para separar el ARN intacto del ADN y las proteínas. Aunque es muy eficaz para aislar el ARN total, este método requiere mucho tiempo y, dependiendo de cuántas muestras tenga, acceso a una o más ultracentrífugas grandes y costosas.

Figura 1: Un esquema de los diferentes pasos en la extracción de ARN.

Los investigadores de los NIH a mediados de la década de 1980 se propusieron desarrollar un protocolo que evitara por completo la ultracentrifugación. Chomczynski y Sacchi mostraron que el ARN podía separarse eficazmente del ADN y las proteínas mediante un protocolo de extracción simple con tiocianato de guanidinio, fenol y cloroformo. En este método, las muestras siguen homogeneizadas y lisadas en una solución de tiocianato de guanidinio. Sin embargo, en lugar de la separación de ARN utilizando gradientes de cloruro de cesio, se agregan fenol saturado de agua, acetato de sodio y cloroformo al homogeneizado y se agitan. Después de una centrifugación rápida (¡no ultracentrifugación!), las capas de fenol y cloroformo se separan, y el ARN se retiene en la capa acuosa superior, mientras que el ADN y otras proteínas se retienen en la interfase y la capa orgánica inferior. La capa acuosa superior se extrae y el ARN puede precipitarse con isopropanol. Este método redujo el tiempo necesario para aislar el ARN de más de 20 horas a alrededor de 4 horas, y las variaciones de este método sin kit todavía se usan ampliamente hoy en día (Chomcynski y Sacchi, 2006).

¡Vea nuestro protocolo para extracción de ARN!

Haciendo que el protocolo simple sea aún más infalible (¡aún sin kit!)

Como se mencionó anteriormente, trabajar con ARN requiere mantener sus muestras frías hasta la homogeneización y la lisis celular. Esto puede ser un desafío dependiendo de su situación de laboratorio o método de recolección de tejidos, por lo que las compañías de biotecnología han comercializado varios productos que ayudan a simplificar aún más este proceso y/o estabilizar el ARN durante la recolección y homogeneización de tejidos. El más conocido de estos productos es TRIzol® (también llamado TRI Reagent®, RNAzol®, QIAzol® y vendido por muchas compañías diferentes). TRIzol ® es una solución de ácido-guanidinio-fenol todo en uno que combina la solución de homogeneización y la adición de fenol del protocolo original sin kit en un solo paso. Después de la homogeneización en TRIzol®, el material insoluble se elimina por centrifugación y el sobrenadante se extrae con cloroformo como en el método sin kit anterior.

Los investigadores también han desarrollado formas de» estabilizar » el ARN dentro de los tejidos antes de la lisis celular. Estos productos, a saber, RNAlater ® de Thermo y RNAProtect® de Qiagen, son soluciones a base de sulfato de amonio que funcionan inhibiendo la actividad de la RNasa dentro de las células o tejidos, en realidad no estabilizan químicamente las moléculas de ARN (Allewell y Sarma, 1974). Además, ThermoFisher proporciona un protocolo sobre cómo integrar RNAlater ® con el uso de TRIzol® y las soluciones estabilizadoras de sulfato de amonio se pueden hacer en casa.

Un problema común con los métodos de extracción de ARN sin kit es el arrastre de ADN que puede complicar los resultados de una aplicación posterior, como la PCR cuantitativa para evaluar la expresión génica. Hay varias cosas que los investigadores pueden hacer para combatir este problema. En primer lugar, tenga en cuenta sus extracciones: si necesita ARN realmente limpio, es importante asegurarse de que al extraer, solo tome la capa acuosa para evitar el arrastre de ADN de la capa orgánica inferior. Otro truco es precipitar el ARN usando cloruro de litio. Las soluciones LiCl precipitan selectivamente el ARN, pero no el ADN y las proteínas. Por último, el uso de una DNasa (hay varios productos de enzima DNasa en el mercado para elegir) en su muestra de ARN resuspendido ayudará a garantizar que la contaminación del ADN no sea un problema.

Chirgwin JM, Przybyla AE, MacDonald RJ, Rutter WJ (1979) Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry 18: 5294-5299. https://doi.org/10.1021/bi00591a005

Chomczynski P, Sacchi N (2006) The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate–phenol–chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols 1:581–585. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.83