retkikunta Etelä-Amerikkaan
humboldtissa oli kasvanut vakaumus siitä, että hänen todellinen päämääränsä elämässä oli tieteellinen etsintä, ja vuonna 1797 hän erosi virastaan hankkiakseen hyvin määrätietoisesti perusteellisen tiedon geodeettisten, meteorologisten ja geomagneettisten mittausten järjestelmistä. Napoleonin sotien aiheuttamat poliittiset mullistukset estivät useiden tieteellisten tutkimusmatkojen toteuttamisen, joihin Humboldt oli saanut mahdollisuuden osallistua. Lopulta pettymyksensä lannistamana, mutta kieltäytyen luopumasta tarkoituksestaan, hän sai Espanjan hallitukselta luvan vierailla Espanjan siirtomaissa Keski-ja Etelä-Amerikassa. Näihin siirtokuntiin pääsivät tuolloin vain espanjalaiset virkamiehet ja roomalaiskatolinen lähetysasema. Täysin eristyksissä ulkomaailmasta ne tarjosivat valtavia mahdollisuuksia tieteelliselle tutkimusmatkailijalle. Humboldtin yhteiskunnallinen asema takasi hänelle pääsyn virallisiin piireihin, ja Espanjan pääministeristä Mariano de Urquijosta hän löysi valistuneen miehen, joka tuki hänen hakemustaan kuninkaalle saadakseen kuninkaallisen luvan. Kesällä 1799 hän purjehti Marseillesta mukanaan ranskalainen kasvitieteilijä Aimé Bonpland, jonka hän oli tavannut Pariisissa, joka oli tuolloin Euroopan vilkkain tieteellinen keskus. Äitinsä kuoltua perimänsä tilan ansiosta Humboldt pystyi rahoittamaan retken kokonaan omasta pussistaan. Humboldt ja Bonpland viettivät viisi vuotta, vuosina 1799-1804, Keski-ja Etelä-Amerikassa ja kulkivat yli 9650 kilometriä jalan, ratsain ja kanooteilla. Se oli suuren fyysisen rasituksen ja vakavan puutteen elämää.
Caracasista alkaen he kulkivat etelään ruohikko-ja pensaikkomaiden läpi, kunnes saapuivat Apuren, Orinocojoen sivujoen, rannoille. He jatkoivat matkaansa jokea pitkin kanootilla aina Orinocoon saakka. Sen ja Casiquiarejoen kulkua seuraten he todistivat, että Casiquiarejoki muodosti yhteyden Amazonin ja Orinocojoen laajojen jokijärjestelmien välille. Kolmen kuukauden ajan Humboldt ja Bonpland liikkuivat tiheissä trooppisissa metsissä hyttyspilvien piinaamina ja kostean kuumuuden tukahduttamina. Hyönteiset ja sade tuhosivat pian heidän ruokansa; ravinnon puute ajoi heidät lopulta elämään jauhetuilla luonnonvaraisilla kaakaopavuilla ja jokivedellä. Kuitenkin molemmat matkalaiset, joita uusien ja musertavien vaikutelmien tuoma jännitys piristi, pysyivät terveinä ja hyvillä mielin, kunnes he palasivat takaisin sivistyksen pariin, jolloin he menehtyivät ankaraan kuumeeseen.
oltuaan lyhyen aikaa Kuubassa Humboldt ja Bonpland palasivat Etelä-Amerikkaan laajalle Andien tutkimusmatkalle. Bogotásta Trujilloon Peruun he vaelsivat Andien ylängöillä-seuraten reittiä, jota nykyään halkoo Pan-Amerikan Maantie, aikanaan sarja jyrkkiä, kivisiä ja usein hyvin kapeita polkuja. He kiipesivät useille huipuille, mukaan lukien kaikki Quiton ympäristössä Ecuadorissa sijaitsevat tulivuoret; Humboldtin nousu Chimborazossa (20702 jalkaa ) 5878 metrin korkeuteen, mutta alle huipun, säilyi maailman vuorikiipeilyennätyksenä lähes 30 vuotta. Kaikki nämä saavutukset toteutettiin ilman nykyaikaisia vuorikiipeilyvarusteita, ilman köysiä, kramponeita tai happivarastoja; siksi Humboldt ja Bonpland kärsivät pahoin vuoristotaudista. Mutta Humboldt käänsi epämukavuutensa edukseen: hänestä tuli ensimmäinen ihminen, joka syytti vuoristotautia hapenpuutteeseen suurten korkeuksien harvinaisessa ilmassa. Hän tutki myös Etelä-Amerikan länsirannikon edustalla olevaa merivirttä, joka oli alun perin nimetty hänen mukaansa, mutta tunnetaan nykyään Peruvirtana. Kun parivaljakko saapui Quitoon, kokeneella vuorikiipeilijällä ja väsymättömällä tieteellisen tiedon kerääjällä Humboldtilla ei ollut vaikeuksia omaksua hovimestarin ja maailmanmiehen roolia, kun varakuningas ja espanjalaisen yhteiskunnan johtajat ottivat hänet vastaan.
keväällä 1803 nämä kaksi matkaajaa purjehtivat Guayaquilista Meksikon Acapulcoon, jossa he viettivät retkensä viimeisen vuoden tutkiessaan tarkasti tätä Espanjan siirtomaiden kehittyneintä ja sivistyneintä osaa. Oltuaan lyhyen aikaa Yhdysvalloissa, jossa Humboldt sai Yhdysvaltain Pres. Thomas Jefferson, he purjehtivat Ranskaan.
Humboldt ja Bonpland palasivat mukanaan valtava määrä tietoa. Uusien kasvien laajan kokoelman lisäksi tehtiin pituusasteiden ja leveysasteiden määrityksiä, maan geomagneettisen kentän komponenttien mittauksia, lämpötilojen ja ilmanpaineen päivittäisiä havaintoja sekä tilastotietoja Meksikon sosiaalisista ja taloudellisista olosuhteista. Aina kun Humboldt oli löytänyt itsensä kaupankäynnin keskus Amerikassa, hän oli lähettänyt pois raportteja ja jäljennöksiä hänen kokoelmat hänen veljensä, Wilhelm, joka oli tullut huomattava filologi, ja Ranskan tutkijat; valitettavasti brittialusten silloinen mannermaasaarto esti suurinta osaa hänen postistaan pääsemästä määränpäähänsä.