Abstrakti
Eyebright, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae) on lääkekasvi, jota on perinteisesti käytetty Euroopassa erilaisten terveyshaittojen hoitoon, erityisesti silmänlumeena bakteeri-infektioihin liittyvien silmävaivojen, kuten sidekalvontulehduksen ja luomitulehduksen, hoitoon. Joidenkin Euphrasia-lajien on aiemmin raportoitu sisältävän eteeristä öljyä. E. rostkoviana-öljyn koostumusta ja bioaktiivisuutta ei kuitenkaan tunneta. Siksi tässä tutkimuksessa selvitimme silmämunan eteerisen öljyn kemiallista koostumusta ja antimikrobista aktiivisuutta joitakin silmäinfektioihin liittyviä organismeja vastaan: Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Pseudomonas aeruginosa ja Candida albicans. GC-MS-analyysi paljasti yli 70 aineosaa, joista n-heksadekaanihappo (18,47%) on tärkein aineosa, jota seuraavat tymoli (7,97%), myristiinihappo (4,71%), linalooli (4,65%) ja anetoli (4,09%). Eteerisellä öljyllä oli antimikrobinen vaikutus kaikkiin testattuihin organismeihin P. aeruginosaa lukuun ottamatta. Paras aktiivisuus havaittiin kaikilla testatuilla grampositiivisilla bakteereilla, joiden inhibitoriset vähimmäispitoisuudet olivat 512 µg / mL. Tämä on ensimmäinen raportti E. rostkoviana eteerisen öljyn kemiallisesta koostumuksesta ja sen antimikrobisesta vaikutuksesta.
1. Johdanto
Eyebrightia, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), on käytetty Euroopassa vuosisatojen ajan perinteisenä lääkkeenä erilaisten sairauksien hoitoon. Decoctions ja infuusiot kukinnan antenni osat käytetään kuivaa yskää, käheys, oireenmukainen hoito kylmä, korvasärky, ja päänsärky, heinänuha, märkivä ihovaurio, tai katarraalinen sairauksien suoliston, mutta erityisesti silmänlumetta hoitoon ja estää silmien häiriöt, kuten sidekalvotulehdus, luomitulehdus, silmien väsymys, märkivä silmän tulehdus, ja sties . Eyebright-teen käytöstä on raportoitu myös etnoveteriinilääketieteessä lehmän silmätulehduksen hoidossa . Huolimatta vuosisatoja perinteisestä käytöstä silmävaivojen hoitoon, on ollut vain yksi prospektiivinen kohorttitutkimus, joka vahvisti Euphrasia-silmätippojen tehokkuuden sidekalvontulehduksen hoidossa, ja yksi kliininen tutkimus, jossa tutkittiin silmätippojen paikallisen käytön vaikutusta antibioottien kulutukseen vastasyntyneillä . Lisäksi antimikrobisen vaikutuksen kirjo on ollut täysin tuntematon, ennen kuin joidenkin Euphrasia-uutteiden antikandidaalista ja antibakteerista vaikutusta on äskettäin raportoitu.
E: n terapeuttinen vaikutus. rostkoviana voidaan katsoa johtuvan pääasiassa sen antioksidantti, anti-inflammatorinen ja antimikrobinen aktiivisuus . E. rostkoviana-uutteissa aiemmin tunnistetuista yhdisteistä apigeniini, luteoliini, kaempferoli, kversetiini, kaffeiinihappo, kumariinihappo ja rosmariinihappo voivat olla vastuussa antimikrobisesta vaikutuksesta. Vaikka eteerisen öljyn (eo) esiintymisestä E. officinalis L.: ssä ja E. stricta Kuntissa on aiemmin raportoitu, E. rostkoviana Eo: n koostumusta ja bioaktiivisuutta ei tunneta. Siksi tässä tutkimuksessa tutkimme eyebright EO: n kemiallista koostumusta ja antimikrobista aktiivisuutta kolmen grampositiivisen bakteerin (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus ja S. epidermidis) ja kolmen Gramnegatiivisen bakteerin (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae ja Pseudomonas aeruginosa) ja yhden hiivan (Candida albicans), jotka ovat yleisesti silmätulehduksiin liittyviä organismeja.
2. Materiaali ja menetelmät
2.1. Kemikaalit ja kasviaineisto
aidot standardit borneoli, kamferi, karvakroli, karvoni, karyofylleeni, p-kymeeni, estragoli, eukalyptoli, limoneeni, linalooli, mentoli, mentoni, β-myrseeni, γ-terpineeni ja tymoli eo-komponenttien tunnistamista varten sekä kontrolliantibiootit siprofloksasiini ja tiokonatsoli ostettiin Sigma-Aldrichilta (Praha, Tšekki). Liuottimina käytettiin heksaania (Merck, Praha, Tšekki), dimetyylisulfoksidia (DMSO) (Lach-Ner, Neratovice, Tšekki) ja Tween 80: tä (Sigma-Aldrich, Praha, Tšekki). EO: n tislauksessa käytetty kasviaines ostettiin kaupallisista lähteistä (F-DENTAL, Hodonín, Tšekki). Eo uutettiin hydrodistillaatiolla Clevenger – tyyppisellä laitteella.
2, 2. EO: n kemiallinen analyysi kaasukromatografia-massaspektrometrialla (GC-MS)
E. rostkoviana eo analysoitiin GC-MS: llä käyttäen Agilent 7890A GC: tä yhdistettynä Agilent 5975C: n yhden kvadrupolin massailmaisimeen, joka on varustettu HP-5ms-kolonnilla (30 m × 0,25 mm, 0,25 µm kalvo) Agilentista (Santa Clara, CA, USA). Heksaania käytettiin liuottimena ja 1 µL : n näytetilavuus ruiskutettiin jakotilassa (suhde 20: 1) injektoriin, joka kuumennettiin 250°C: seen.uunin alkulämpötila asetettiin 60°C: seen 3 minuutin ajaksi, ohjelmoitiin 230°C: seen nopeudella 3°c/min, minkä jälkeen se pidettiin vakiona 10 minuutin ajan. Heliumia käytettiin kantokaasuna virtausnopeudella 1 mL / min. MS-analyysi tehtiin täyskuvaustilassa ja elektronien ionisaatioenergiaksi asetettiin 70 eV. Yksittäisten komponenttien tunnistus perustui niiden massaspektri-ja relative retention-indeksien vertailuun National Institute of Standards and Technology Libraryn (NIST, USA) ja kirjallisuuden kanssa sekä autenttisen standardin kolikkovaihteluun.
2, 3. Bakteerikannat ja Viljelyaineet
kolmen grampositiivisen bakteerin Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213 ja S. oksoidista (Basingstoke, Yhdistynyt kuningaskunta) saatiin epidermidis ATCC 12228, kolme Gramnegatiivista bakteeria Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 ja Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 sekä yksi hiiva Candida albicans ATCC 10231. Kationisovitettua Mueller-Hinton-lientä (MHB) ja SABOURAUD-dekstroselientä (SDB) käytettiin viljelyaineena antibakteerisessa ja sienilääkkeisiin perustuvassa mikrodiluutiotestissä, ja ne tasapainotettiin Tris-puskuroidulla suolaliuoksella (Sigma-Aldrich, Praha, Tšekki). Mueller-Hinton agaria (MHA) ja Sabouraud dekstrose agaria (SDA) käytettiin bakterisidisten ja fungisidisten pitoisuuksien myöhempään määrittämiseen. Kaikki mediat ostettiin Oxoidilta (Basingstoke, Yhdistynyt kuningaskunta).
2, 4. Pienimmän inhibitorisen pitoisuuden (Mic) määrittäminen
MIC-arvot määritettiin käyttäen in vitro-liemimikrodiluutiomenetelmää Clinical and Laboratory Standards Instituten (CLSI) ohjeiden mukaisesti muutettuina luonnontuotteiden anti-infektoivan potentiaalin tehokkaaksi arvioimiseksi ehdotettujen suositusten mukaisesti käyttäen 96-kuoppaisia mikrotiitterilevyjä. Lyhyesti EO liuotettiin DMSO: hon ja siihen lisättiin Tween 80, ja MHB: ssä valmistettiin kaksinkertaisia sarjalaimennoksia bakteereille ja SDB: ssä hiivalle, kun taas testatut pitoisuudet vaihtelivat 4: stä 2048 µg/mL: aan. Inokulaatti valmistettiin yön yli-viljelmistä siten, että mikromuovien alkuperäiset PMY-pitoisuudet olivat bakteerien osalta 5 × 105 ja hiivan osalta 2 × 103 PMY/mL. Inokuloidut levyt tutkittiin 24 tunnin inkubaation jälkeen 35°C: ssa ja vielä kerran 48 tunnin kuluttua, kun kyseessä oli C. albicans. Mikrobikasvustoa mitattiin spektrofotometrisesti Multiscan Ascent Microplate-fotometrillä (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) 405 nm: n aallonpituudella. Mikrofonit ilmaistiin pienimpinä pitoisuuksina, jotka pystyivät estämään ≥ 80% bakteerikasvusta verrattuna positiiviseen kasvukontrolliin. Kokeet tehtiin kolmena erillisenä testinä, ja MICs-laskennassa käytettiin mediaaniarvoja. Koska äskettäin on raportoitu EO: n haihtuvien komponenttien mahdollisesta vaikutuksesta viereisten kaivojen mikrobikasvustoon , EO: n laimennusrivien väliin lisättiin positiivisia kasvunvalvontarivejä mahdollisen kasvuvaikutuksen havaitsemiseksi. Käytetyt liuottimet eivät estäneet bakteerien kasvua testatuilla pitoisuuksilla. Siprofloksasiinia ja tiokonatsolia käytettiin vertailubiantibiootteina bakteerien ja hiivan hoidossa.
2, 5. Bakterisidisen vähimmäispitoisuuden (MBC) ja fungisidisen vähimmäispitoisuuden(MFC) määrittäminen
20 µL: n alikiintiöt siirrettiin kustakin mikrobikasvuttomasta kaivosta MHA-levyihin (C. albicans-bakteerin SDA-levyihin) tutkittujen bakteerien 24 tunnin inkubaation ja hiivan 48 tunnin inkubaation jälkeen. Tämän jälkeen levyjä inkuboitiin 24 tunnin ajan 35°C: ssa.MBC ja MFC arvioitiin pmy: n vähenemisenä ≥99, 9% verrattuna inokulaattiin.
3. Tulokset ja keskustelu
3.1. Öljyjen ja bioaktiivisten fraktioiden ainesosien kemiallinen karakterisointi
Clevenger-tyyppisellä laitteella tehdystä eo-hydrodistilloinnista saatiin 0,02% (w/v) kellanruskeaa öljyä, jolla on taipumus jähmettyä huoneenlämmössä, mikä johtuu todennäköisesti suuresta rasvahappojen osuudesta (yhteensä 32,23%). GC-MS-analyysi EO: sta paljasti, että siinä on yli 70 ainesosaa, ja palmitiinihappo (18, 47%) on runsain aineosa, jota seuraavat tymoli (7, 97%), myristiinihappo (4, 71%), linalooli (4, 65%), anetoli (4, 09%), linoleenihappo (3, 81%), heksahydrofarnesyyliasetoni (3, 16%), lauriinihappo (2.79%), α-terpineol (2.39%), and borneol (2.39%). The main compounds are shown also in the chromatogram (Figure 1) and the complete list of EO constituents is presented in Table 1.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| R: retention indices relative to n-alkanes on HP-5MS capillary column (30 m × 0.25 mm, 0.25 m); peak area relative to total peak area in %; ID: identification method; a: identification based on mass spectra matching; b: identification based on retention index; c: tunnistetiedot, jotka perustuvat aitoon näytteeseen. d: alustava tunnistetiedot. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
korkea rasvahappopitoisuus on aiemmin todettu E. stricta EO: ssa (yhteensä 25,7%), jossa on myös eniten palmitiinihappoa (20,3%) ja myristiinihappoa (3,9%) . Mitään muuta yhdistettä ei kuitenkaan esiinny merkittävässä määrin, mikä viittaisi näiden kahden Euphrasia-lajin sukulaisuuteen.
3, 2. Antimikrobinen vaikutus
E. rostkoviana EO osoitti aktiivisuutta kuutta seitsemästä mikrobista vastaan, joita testattiin mikrofoneilla 512-2048 µg/mL. Grampositiiviset bakteerit olivat herkempiä kuin Gramnegatiiviset bakteerit ja hiiva, kun taas P. aeruginosa oli ainoa organismi, jota öljy ei estänyt korkeimmilla testatuilla pitoisuuksilla. Eo: n Mikrofonit, MBC: T ja monitoimilaitteet kaikkia testattuja mikro-organismeja vastaan on esitetty taulukossa 2. Aktiiviset pitoisuudet ovat verrattavissa aiemmin ilmoitettuihin pitoisuuksiin esimerkiksi Artemisia annua -, Eucalyptus globulus -, Mentha suaveolens -, Myrtus communis -, Ocimum basilicum-tai Thymus vulgaris-bakteereilla, erityisesti antikandidaalisen vaikutuksen osalta . Öljy oli myös tehokkaampaa kuin E. rostkoviana-uutteet, joita Teixeira ja Silva testasivat E. coli -, E. faecalis -, S. aureus-ja S. epidermidis-bakteereita vastaan. Vertailubiantibioottien Mikrofonit e-virukselle herkkiä bakteereja ja hiivaa vastaan. rostkoviana EO oli CLSI: n hyväksyttävän rajan ja aiempien raporttien mukainen .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| The growth inhibition was measured after 24 h and 48 h of incubation in case of C. albicans; EO: essential oil; CIP: ciprofloxacin; TIO: tioconazole; MIC: minimum inhibitory concentration; IC50: inhibitory concentration causing ≥50% of bacterial growth; MBC: minimum bactericidal concentration; MFC: minimum fungicidal concentration. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
koska EO: n pääainesosan palmitiinihapon pitoisuus on enintään 20% ja muita antimikrobisesti aktiivisia yhdisteitä on yli 10, 1-8%, on vaikea sanoa, mitkä ovat E. rostkoviana EO: n antimikrobisen vaikutuksen pääasialliset aiheuttajat. Palmitiinihappo on aiemmin todettu gramnegatiivisiin, mutta ei grampositiivisiin bakteereihin vaikuttavien fraktioiden tärkeimmäksi yhdisteeksi . Toisaalta keskiketjuisten tyydyttyneiden rasvahappojen ja pitkäketjuisten tyydyttymättömien rasvahappojen tiedetään estävän erityisesti grampositiivisia bakteereja . Lisäksi lauriinihappo tehoaa myös useisiin sieniin . Näin ollen EO: n antimikrobinen vaikutus johtuu todennäköisesti mikrobilääkkeiden rasvahappojen monimutkaisesta vaikutuksesta muiden EO: ssa tunnistettujen tunnettujen antimikrobisten yhdisteiden, kuten anetolin, borneolin, kamferin, karvakrolin, linaloolin, mentolin, α-terpineolin tai tymolin kanssa.
4. Päätelmät
johtopäätöksissä kemiallinen analyysi paljasti useita mikrobilääkeresistenssissä esiintyviä mikrobilääkkeitä. rostkoviana EO ja sen antifungaalinen ja antibakteerinen vaikutus grampositiivisia ja gramnegatiivisia bakteereja vastaan vahvistettiin. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen raportti E. rostkoviana EO: n koostumuksesta ja antimikrobisesta vaikutuksesta.
eturistiriidat
kirjoittajat julistavat, ettei tämän paperin julkaisemiseen liity eturistiriitoja.
kiitokset
tätä työtä tukivat taloudellisesti Euroopan tiedesäätiö ja Tšekin opetus -, nuoriso-ja urheiluministeriön hanke CZ.1.07/2.3.00/30.0040; Tšekin tasavallan opetus -, nuoriso-ja urheiluministeriön s-apuraha ja Tšekin biotieteiden yliopiston Prahan projekti IGA 20155012. Kirjoittajat ovat kiitollisia Slavka Barlakovalle englanninkielisestä oikoluvusta.