negatiivisen värjäyksen päätarkoitus on tutkia vaikeasti värjättävien bakteerisolujen morfologista muotoa, kokoa ja järjestelyä. esim: Spirilla. Sitä voidaan käyttää myös värjäämään soluja, jotka ovat liian herkkiä lämmönkestäviksi.

sitä käytetään myös biologisten näytteiden valmistamiseen elektronimikroskopiaa varten. Sen avulla voidaan tarkastella viruksia, bakteereita, bakteeriflagellaa, biologisia kalvorakenteita ja proteiineja tai proteiiniaggregaatteja, joilla kaikilla on alhainen elektronisirontateho. Sitä käytetään myös vesipitoisten lipidiaggregaattien, kuten lamelliliposomien (le), ylösalaisin käännettyjen pallomaisten misellien (M) ja ylösalaisin käännettyjen heksagonaalisten HII-lieriömäisten (H) faasien tutkimiseen ja tunnistamiseen negatiivisen värjäyksen siirtoelektronimikroskopian avulla.

negatiivisen värjäyksen periaate

negatiivinen värjäys vaatii happaman väriaineen, kuten intialaisen musteen tai Nigrosinin.

Intian muste tai Nigrosiini on hapan tahra. Tämä tarkoittaa, että tahra luovuttaa helposti vetyionin (protonin) ja väriaineen kromofori muuttuu negatiivisesti varautuneeksi. Koska useimpien bakteerisolujen pinta on negatiivisesti varautunut, solun pinta hylkii tahraa. Liukumäen lasi tahraa, mutta bakteerisolut eivät. Bakteerit näkyvät selkeinä täplinä tummaa taustaa vasten.

negatiivisen värjäyksen reagenssit

Intian muste

Nigrosin
Nigrosin 100 gm/L, Formaliini 5 ml/L vedessä

negatiivisen värjäyksen menettely

1. Aseta hyvin pieni pisara (enemmän kuin silmukka täynnä, vähemmän kuin vapaa putoava pisara tiputtimesta) nigrosin lähellä hyvin puhdistetun ja liekehtivän dian toista päätä.

2. Poista pieni määrä viljelyä vinosta inokuloivalla silmukalla ja levitä se tahrapisaraan levittämättä pisaraa.

3. Käytä toinen puhdas dia levittää pisara tahra sisältävät organismin käyttäen seuraavaa tekniikkaa.

4. Lepää puhtaan dian toinen pää keskellä dian tahralla. Kallista puhdasta liukumäkeä kohti pudotusta, joka muodostaa akuutin kulman, ja vedä liukumäkeä kohti pudotusta, kunnes se koskettaa pudotusta ja saa sen leviämään levittimen liukumäen reunaa pitkin. Pidä pieni terävä kulma diojen välillä, työnnä levittimen liukumäkeä kohti tahraavan liukumäen puhdasta päätä vetämällä pudotusta levittimen liukumäen taakse ja tuottamalla laaja, tasainen, ohut tahra.

5. Anna preparaatin kuivua ilman kuumentamista.

6. Tarkenna ohut alue öljyyn upotettuna ja tarkkaile harmaan tahran ympäröimiä kahlitsemattomia soluja.

Transmissioelektronimikroskoopilla (TEM) tarkastelumenetelmä

1. pidä pinnoitettua grid flim-puolta ylhäällä itseliimautuvilla pihdeillä.
2. tehdään 1:1-seos näytteestä ja negatiivisesta tahrasta (esim. 2% uranyyliasetaattia tai 2% natrium-tai kaliumfosfotungstaattia, pH 7,4). Lisätään 5µl verkkoon. Pienemmät hiukkaset Adsorboituvat hilapintaan nopeammin kuin suuremmat hiukkaset.
   vaihtoehtoisesti kiinnikkeeseen sekoitettu näyte voidaan lisätä ruudukkoon ennen seuraavaa negatiivista värjäystä.
3. inkuboidaan 30-90 sekuntia, minkä jälkeen ylimääräinen neste poistetaan
   suodatinpaperin repaleisella reunalla.
4. kuivaa ja tutki TEM: ssä.

negatiivisen värjäyksen tulokset