viisi PAX-6-muunnosta ja niiden ilmentymiskuviot Kalmarin alkioissa ja aikuisten silmäkudoksissa

suoritimme yhden 3′-rodun PCR: n kääpiökalmarin PAX-6-geenille (nimetty IpPax-6: ksi) tutkiaksemme liitosvariantteja ja useita PAX-6 koleoidisilla pääjalkaisilla. Havaitsimme, ettei kääpiökalmarissa ollut useita lokuksia, mutta tunnistimme kolme diskreetin pituista PAX-6-muunnosta. Näiden PAX-6-muunnosten aminohapposekvenssien erot rajoittuivat rajallisille alueille. Siksi niiden oletettiin olevan seurausta vaihtoehtoisista, yhden lokuksen tapahtumista. Seuraavaksi validoimme liittämismuunnosten olemassaolon RT-PCR: llä ja saimme lopulta viisi erilaista liitosmuunnelmaa, mukaan lukien näennäinen ortologiakseli aidosta Pax-6: sta (Kuva 1). Authentic IpPax-6: n pituus ja rakenne olivat samanlaiset kuin muilla kalmarilajeilla, Euprymna scolopesillä ja Loligo pealei15,16: lla, löydetyillä Pax-6-geeneillä. Authentic IpPax-6 (authentic form, 499 aa) koostuu kahdesta itsenäisestä DNA: ta sitovasta domeenista, PD-ja HD-domeeneista sekä C-terminaalisesta P/S/T-rich-domeenista (PST), joka on omistettu aktivaattori kumppanitransaktivaattoriproteiinin kanssa, kuten monilla eläimillä on esitetty (kuva 1). Sekä proteiinisekvenssin samankaltaisuus että fylogeneettinen puu vahvistivat IpPax-6: n olevan kärpäsen ey: n ja selkärankaisen Pax-4/6: n ortogi (täydentävä kuva 1). Neljä tunnistettua muunnosta tuottivat proteiineja, joiden pituudet poikkesivat aidon IpPax-6: n pituuksista (Kuva 1).

tutkiaksemme Kalmarin PAX-6-muunnosten vaiheekspressiota suoritimme Q-PCR: n eri kudoksille ja eri alkioasteille käyttäen alukkeita, jotka oli suunniteltu kohdistamaan IpPax-6: n ylimääräisiä eksoneja (kuva 2 & Kuva S2). Kalmarin munissa esiintyy epibolista gastrulaatiota ja suoraa kehitystä ilman tyypillisiä nilviäisten toukkavaiheita17. Alkiosilmät näkyvät blastodisc: n ulkoisesta lisäkiveksestä ja ovat differentioituvia vaiheen 18 jälkeen, verkkokalvon pigmentaatio alkaa vaiheesta 20. Linssi näkyy läpinäkyvänä tikkumaisena rakenteena, joka näkyy paljaalle silmälle vaiheessa 25. Suoritimme ensimmäisen kerran Q-PCR: n käyttäen Exon 2: een kohdistettuja alukkeita, jotka kattavat kaikki viisi varianttia. Q-PCR-analyysi osoitti, että IpPax-6 ilmaistiin vaiheessa 16 ennen silmärakkulan muodostumista (Kuva 2a). IpPax-6: n ilmentymisvoimakkuutta säädeltiin vähitellen Kalmarin alkion kehittymisen myötä (kuva 2a), silmämunan osoittaessa korkeimmat ilmentymisvoimakkuudet testatuista kudoksista. Kuten muillakin bilateraalisilla eläimillä, IpPax-6: n autenttiset ja muunnokselliset muodot ilmenivät lihaskudoksen selvästi alenevina tasoina. Sen jälkeen käytimme alukkeita, joista puuttui exon 4 (vaihtoehdot 1 ja 3, kuva 2b). Alukkeet havaitsivat variantteja 1 ja 3 pieninä pitoisuuksina alkioissa vaiheessa 16 ja silmämunakudoksessa. Käytimme myös alukkeita kohdistusvariantteja, kuten exon 6 (vaihtoehdot 2 ja 3, kuva 2C). Q-PCR-analyysi osoitti, että variantteja 2 ja 3 ilmeni silmämunissa ja optisissa lohkoissa sekä alkioissa vaiheissa 16 ja 25. Koska fotoreseptorisolujen ja linssin muodostuminen alkaa alkioissa vaiheessa 25, variantit mukaan lukien eksoni 6 voivat edistää silmän kehitystä. Tulokset osoittavat, että IpPax-6-muunnosten ilmaisumallit poikkesivat merkittävästi aidosta IpPax-6: sta.

erottaaksemme, mitä variantteja kussakin vaiheessa esiintyy, suoritimme RT-PCR: n käyttäen primer-sarjoja yli eksonirajojen. Muunnoksen 1 katsottiin ilmenevän kaikissa / joissakin alkion vaiheissa, mutta ei aikuisten silmissä (täydentävä kuva 2). RT-PCR-analyysi osoitti myös, että muunnos 4 ilmeni voimakkaasti aikuisten silmissä, erityisesti verkkokalvossa, mutta ei linsseissä (täydentävä kuva 2A). Variantteja 2 ja 3 ilmaistiin kaikissa alkion vaiheissa ja myös aikuisten kudoksissa (täydentävä kuva 2B).

tunnistaaksemme IpPax-6-muunnosten kudosspesifisen ilmentymän suoritimme in situ–hybridisaation käyttäen RNA-luotaimia, jotka oli suunniteltu sitoutumaan nimenomaan kuhunkin muunnokseen (Kuva 2D-G). Ekson 2: sta suunniteltu RNA-luotain tähtää kaikkiin tässä tutkimuksessa tunnistettuihin viiteen varianttiin. Ekson 4: stä suunniteltu RNA-luotain sidottiin autenttiseen muotoon ja muunnelmiin 2 ja 4. IpPax-6 todettiin lokalisoitu aivojen alueella, mukaan lukien dorsal basal lohko, superior otsalohko, kanta/hajuaistin lohkoa ja optinen lohkoa (Kuva 2D–G), kuvattu Hartmann et al.18 verkkokalvon ulkopuolisessa kudoksessa (joka ehkä vastaa tulevaa iridoforikerrosta) ilmeni myös selvästi IpPax-6 vaiheessa 22 (kuvat 2D ja 2D’). IpPax-6 ilmentymistä havaittiin tässä kerroksessa vaiheeseen 25 asti. In situ-hybridisaatio, jossa luotain kohdisti kohteensa ekson 4: ään, viittasi siihen, että muunnoksilla 2 ja 4 oli samanlaiset ilmentymäkuviot aivoissa, mutta ei silmissä (Kuva 2e). Tämä havainto viittaa siihen, että variantit 1 ja 3 (puuttuu eksoni 4) ovat yläsääntelyssä silmien uloimmassa kerroksessa. Nämä seuraukset merkitsevät sitä, että jokaista IpPax-6-muunnosta säännellään itsenäisesti silmien muodostumisen prosesseissa.

Pax-6: n Ekson-intronirakenne muissa pääjalkaisissa/nilviäisissä

selvitimme, onko tällaista vaihtoehtoista liitosta saatu vain koleoidisissa pääjalkaisissa. Sovellettaessa RT-PCR-analyysiä japanilaiseen keihäskalmariin (Loligo bleekeri), alkion RNAS, löysimme kolmenlaisia mRNAs mahdollisesti peräisin vaihtoehtoisesta liitoksesta (exon 4 ohita, exon 3 lisäys ja exon 6 lisäys) silmissä (Kuva 3A, B). Lisätyt eksonit 3 koodasivat 20 ja 6 40 aminohappoa, kun taas ohitettu eksoni 4 koodasi 51 aminohappoa. Selvittääksemme, esiintyykö muissa nilviäisten genomeissa samanlaisia vaihtoehtoisia liitoksia, tutkimme PAX-6: n eksoni-intronirakenteita pöllö-limpetissä ja helmiäisosterissa. Pöllöpöllön (Lottia gigantea, saatu JGI genomiportaalista Lotgi v1.0, e_gw1.86.103.1)19 ja helmiäisosterin (Pinctada fucata, saatu Oist Marine Genomics Unit genomiselaimesta P. fucata_ver1.0, transkriptio: pfu_aug1.0_8418.1_67856.t1, scaffold8418.1) 20 osoitti, että molluscan Pax-6: lla on viisi eksonia. Mustekalan ekson 4 säilyi läpi testattujen nilviäislajien. Eksoneja 3 ja 5 ei kuitenkaan löydetty helmiäisosteri Pax-6-geenistä. Niinpä huomasimme, että koleoidisesta pääjalkaisten sukulinjasta on saatu muunnokset 2 ja 4 (kuva 1).

parhaan tietämyksemme mukaan tutkimuksemme on ensimmäinen, joka raportoi kehyksensisäisiä squid Pax-6-muunnoksia, jotka ilmaistiin eri tavoin alkiovaiheen mukaan. Aiemmissa tutkimuksissa eroteltiin toisistaan erillisiä jatkomuunnoksia, jotka olivat menettäneet PD-alueen n-terminaalisen puoliskon muissa kalmarilajeissa15,18, mutta näissä muunnoksissa ei ilmennyt spatiaalisia ja ajallisia eroja ilmaisussa. Tutkimuksemme osoitti myös, että PAX-6-transkriptien variaatioiden taustalla olevat mekanismit vaihtoehtoisella liitoksella on hankittu ainutlaatuisesti coleoid-pääjalkaisten sukuun, koska alempien nilviäisten, kuten simpukoiden, genomeissa ei ole vastaavaa eksonin kaltaista fragmenttia.

squid Pax-6-muunnosten toiminta ja niiden oletettu rooli silmän kehityksessä

vaihtoehtoisesti käytettäviin eksoneihin koodatun aminohappofragmentin lisäämisen ja poiston odotetaan aiheuttavan rakenteellisia muutoksia IpPax-6-proteiinivarianteissa, mikä saattaa muuttaa niiden toimintaa kehitysprosessissa. Kahdesta sen muunnelmasta (muunnelmat 1 ja 3) puuttuu 153mer keskellä aito Pax-6 ja puolet HD (kuva 1). Tutkiaksemme, vaikuttaako poisto niiden toiminnallisiin ominaisuuksiin, teimme proteiinien kolmiulotteisia (3D) rakenteellisia ennusteita vertailevan mallinnuksen perusteella. Aidon IpPax-6: n HDS: n oletetut 3D-rakenteet ja variantti, josta puuttui ekson 3: n koodaama segmentti, rakennettiin. Mallirakenne tunnistettiin DNA: han sitoutuneen muodon avulla, jotta pystyimme ennustamaan IpPax-6: n rakenteen ja muunnoksen DNA: han sitoutuneessa muodossa. Autenttisen muodon putatiivinen 3D-rakenne oli kohtuullisen hyvin mallinnettu; ydinjäämät, eli Phe silmukassa ennen HD: n ensimmäistä helixiä, Leu ensimmäisellä helixillä, Leu toisella helixillä ja Trp ja Phe mallirakenteen kolmannella helixillä, säilytettiin ja HD: n kolme helixiä ilmeisesti pakattiin tiiviisti toisiinsa (Kuva 3C). DNA: n sitoutumisen kannalta tärkeät jäämät eli kaksi Arg: n jäämää N-terminaalihaarassa ja polaariset jäämät kolmannen helixin pinnalla sijaitsivat kohtuullisen lähellä DNA-rajapintaa (Kuva 3C, D). Muunnoksen oletettu 3D-rakenne esitti kuitenkin useita ongelmallisia kysymyksiä. Mallinnetussa rakenteessa eksoni 3: n koodaaman alueen häviämistä, joka koodaa ensimmäisen helixin N-terminaalista osaa, kompensoi 15 eksoni 2: een koodattua jäämää. Näin ollen aitouden ja variantin muotojen aminohapposekvenssit erosivat toisistaan vain alueella, joka sisälsi n-terminaalisen puolen 15 jäämää. Tämä ero kuitenkin lisäsi merkittävästi muunnoksen rakenneenergiaa ja ilmeisesti horjutti kokonaisrakennetta. Tämä epävakaus voi johtua siitä, että silmukasta puuttuu Phe ennen ensimmäistä helixiä ja Leu ensimmäisestä helixistä. Nämä komponentit ovat ilmeisesti tärkeitä kolmen kierteen pakkaamisessa. Lisäksi muunnoksesta puuttui kaksi N-terminaalisessa silmukassa olevaa Arg-jäämää, jotka sitoutuvat DNA-emäksiin molliurassa autenttisessa muodossa. Nämä ongelmat muunnoksen stabiilisuudessa ja DNA: n sitoutumisessa viittaavat vahvasti siihen, että muunnoksen HD on epävakaa ja että domeenilla on vain vähän sitoutumisaffiniteettia DNA: han (Kuvat 3D ja 3D’). Stabiilin HD: n puuttuminen viittaa myös siihen, että muunnoksilla 1 ja 3 on erilaiset DNA-kohdepaikat kuin aidolla IpPax-6: lla kalmarilajeilla.

kahdessa muunnoksessa (muunnokset 2 ja 3) esiintyi myös 120 mer: n lisäys PST-toimialueen sisällä (kuva 1). Lisätyn sekvenssin todettiin koskevan erityisesti kalmareita (kuva 2). Tämä lisäys saattaa muuttaa trans-aktivointi toimintaa PST verkkotunnuksen. Variant 4: ssä oli ainutlaatuinen lisäys (57 mer) PD: n ja HD: n väliin. Motif-ohjelma (http://www.genome.jp/tools/motif/) ei löytänyt lisättyyn sekvenssiin tunnettuja verkkotunnuksia tai allekirjoituksia. Tämä lisäys pidentää linkittäjää PD-ja HD-verkkotunnusten välillä.