HPV/p16-positiivisten ja negatiivisten hnscc-syöpien etäpesäkkeissä osoittavat erot solmukohtien osallistumisessa
määritimme HPV-ja p16-statuksen 241: lle nielun okasolusyöpäpotilaalle, joita hoidettiin (chemo) sädehoidolla (C)RT. Ihmisen kasvainnäytteet hankittiin Leuvenin (Leuven, Belgia) yliopistosairaaloiden eettisen lautakunnan hyväksymien protokollien mukaisesti ja kaikkien potilaiden hiljaista suostumusta saatiin. Klinikopatologiset tiedot poimittiin potilaskartoista, ja keskimääräinen seuranta-aika oli 4, 19 vuotta. HPV-positiivisille potilaille oli ominaista alempi T-vaihe, jossa 45%: lla (26 potilasta 58: sta; p = 0, 025) HPV-positiivisista potilaista todettiin T1/2-vaiheen kasvaimia, kun taas HPV-negatiivisessa ryhmässä tämä oli 29% (51 potilasta 175: stä; p = 0, 025). Lisäksi HPV-positiiviset kasvaimet olivat huomattavasti korkeampia (p = 0.014) solmukohtiin liittyminen HPV-positiivisista potilaista, joilla N2/N3-kasvaimia esiintyi 72%: lla (42 / 58), kun taas HPV-negatiivisessa ryhmässä tämä oli vain 54% (95 / 175). Vaikka P16-statuksen ja N-vaiheen välinen suhde ei ollut merkittävä, havaittiin suuntaus korkeampaan solmukohtien osallistumiseen ja p16-positiivisuuteen. P16-positiivisista potilaista 63%: lla todettiin N2/N3-kasvaimia, kun taas P16-negatiivisessa ryhmässä tämä oli vain 54% (Taulukko 1). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia muiden tutkimusten kanssa, ja ne osoittavat, että HPV-positiivisilla HNSCC-potilailla on korkeampi N-ja alempi T-vaihe .
odotetusti matalat t-vaiheet johtivat parempiin etäkontrolleihin (DC), Kun 5 vuoden kontrolliaste oli 83% ja 70% (p = 0, 04) T1-ryhmässä/T2 ja T3/4 kasvaimet (lisätiedosto 1: kuva S1A). N2/3-kasvaimet (5-vuoden DC 70%; p = 0, 02) osoittivat suuremman riskin kaukaiselle epäonnistumiselle kuin N0 / 1-kasvaimet (5-vuoden DC-korko 85%; p = 0, 02) (Lisätiedosto 1: kuva S1B). HPV-positiivisten ja negatiivisten tautien DC-määrässä ei havaittu tilastollisesti merkitsevää eroa (5 vuoden DC-esiintyvyys 82% ja 5 vuoden DC-esiintyvyys 72%; P = 0, 20) (Lisätiedosto 1: kuva S1C). Vaikka ei ole merkittävää, tämä 10% ero DC hinnat viittaa vaikutus viruksen ulkopuolella paikallisen kasvaimen valvontaa. Lisäksi se osoittaa, että HPV-positiivisen ja negatiivisen HNSCC: n välillä on erilaisia leviämismalleja.
P16 tukahduttaa HPV-positiivisen HNSCC: n invaasio-ja migraatiokyvyn
tutkiaksemme molekulaarista mekanismia näiden etäpesäkkeissä Havaittujen mahdollisten erojen takana potilaskoohortissamme arvioimme hnscc-solujen in vitro-migraatio-ja invaasiokykyä. HPV / p16-positiivisten SCC154-ja SCC104-solujen migraationopeus oli merkitsevästi pienempi kuin HPV/p16-negatiivisten SQD9 -, CAL27-ja SC263-solujen (Kuva. 1 A). Migraatiomäärityksen mukaisesti HPV/p16-positiivisilla soluilla oli heikentynyt invaasiokyky verrattuna HPV / p16-negatiivisiin soluihin (Kuva. 1b).
p16 represses the in vitro invasion and migration capacity of HPV positive HNSCC. a Migration capacity of HPV negative cells (SQD9, CAL27 and SC263) and HPV positive cells (SCC154, SCC104). b Invasion capacity of HPV negative SQD9 cells and HPV positive SCC154 cells. c Migration capacity of HPV positive SCC154 cells treated with shRNA for p16 (shp16) and control (shluc). d SHRNA: lla hoidettujen HPV-positiivisten SCC154-solujen Invaasiokyky p16: n (shp16) ja kontrollin (shluc) osalta. (a-d) tulos esitetään kolmen kokeen keskiarvona ± sem ja p-arvot lasketaan kaksipuolisella t-testillä
tuumorisuppressori p16 on tunnettu solusyklin säätelijä ja hyvä HPV-positiivisen HNSCC: n korvaava markkeri . Lisäksi viimeaikaiset tiedot antavat p16: lle laajemman roolin, mukaan lukien roolin muuttoliikkeessä ja angiogeneesin tukahduttamisessa . Siksi tutkimme myös P16: n vaikutusta HPV-positiivisten SCC154-solujen migraatio-ja invaasiokykyyn, jota manipuloitiin lyhyellä hiusneula-RNA: lla (shRNA) p16: lle (shp16) ja kontrolli-shrnalle (shluc). P16-ilmentymän alasääntely lisäsi SCC154-solujen migraatio-ja invaasiokapasiteettia (Kuva. 1c ja d). Nämä tiedot vahvistavat HPV-positiivisen ja negatiivisen HNSCC: n väliset erot leviämismalleissa ja viittaavat p16: n aktiiviseen rooliin metastasoituneessa kaskadissa.
p16 estää migraatiota ja invaasiota HPV-positiivisessa hnscc: ssä
on hyvin tunnettua, että angiogeneesi, jota aktiivisesti ylläpitävät syöpäsoluissa pro-angiogeeniset tekijät, kuten verisuonten endoteelikasvutekijä A (VEGFA), on syöpäsolujen leviämisen ja etäpesäkkeiden kanava ja edistää aggressiivista kasvaimen etenemistä . Lisäksi HPV/p16: n ja VEGFA: n välinen negatiivinen korrelaatio on aiemmin kuvattu hnscc: ssä . Siksi arvioimme HPV: n, p16: n ja VEGFA: n suhdetta potilaskohorttiimme. HPV-positiivisilla potilailla VEGFA-ekspressio oli merkitsevästi vähäisempi: 54%: lla (28: lla 51: stä) potilaista VEGFA-ekspressio oli olematon tai alhainen verrattuna HPV-negatiivisessa ryhmässä 32%: iin (53: lla 161: stä) (Taulukko 2). Vaikka negatiivinen korrelaatio VEGFA: n ja p16: n välillä oli vähäisempi, havaittiin suuntaus merkitsevyyteen (Taulukko 2).
selvitimme edelleen angiogeneesin ja P16: n välistä yhteyttä in vivo KSENOGRAFTEILLA, jotka ruiskutettiin SCC154 HPV-positiivisilla soluilla, joita oli manipuloitu shp16: lla tai shluc. Suurempi määrä verisuonia havaittiin hiirillä kasvaimia, joilla oli alhainen p16 ilmentymä verrattuna verrokkikasvaimiin (Fig. 2 a). Lisäksi vaskularisaation lisääntyminen johti pienempään nekroosiin, suurempaan mitoottisten solujen määrään ja shp16: n kasvaimia ilmentävän kasvun etuun (Lisätiedosto 2: Kuva S2A-C). Emme voineet varmistaa P16: n osuutta etäpesäkkeiden estämisessä in vivo, koska etäpesäkemallia ei ollut. Kuitenkin kasvu etu ja lisääntynyt verisuonitus nähdään shp16 hiirillä kasvaimia voi selittää usein esiintyminen pitkälle t vaiheissa HPV negatiivinen HNSCC potilailla.
P16: n kaksoisrooli HNSCC: n levittämisessä. verisuonten muodostuminen SCC154 shp16 ja SCC154 shluc ksenograft – hiirimalleissa, jotka arvioitiin CD31-värjäyksellä (kaavion yläpuolella); N = 5. b lymfasuonien keskimääräinen lukumäärä SCC154 shp16 – ja SCC154 shluc xenograft-hiirimalleissa arvioituna LYVE-1-värjäyksellä (graafin yläpuolella); N = 5. c alpha4 beta1 integriinivärjäyksen keskiarvo SCC154 shp16-ja SCC154 shluc-hiirisiirtomalleissa; N = 5. d Average score of alpha4 beta1 integrin staining in HPV positive SCC154 (n = 7) and HPV negative SQD9 (n = 10) mouse xenograft models. a-d P-arvot on laskettu kaksipuolisella t-testillä
P16 stimuloi lymfangiogeneesiä ja solmukohtien leviämistä HPV-positiivisilla hnscc-potilailla
nämä tulokset eivät edelleenkään selitä samankaltaisten kaukaisten relapsien esiintymistä HPV/p16-positiivisilla ja-negatiivisilla HNSCC-potilailla eivätkä varmastikaan selitä erittäin merkittävää yhteyttä HPV-positiivisuus ja solmukohtien osallistuminen kuvattu meidän ja useissa muissa tutkimuksissa . Tämä on erityisen tärkeää, koska se viittaa HPV-positiivisessa HNSCC: ssä esiintyvään suureen paikalliseen metastaattiseen potentiaaliin. Mielenkiintoista lymfangiogeneesi, kuten angiogeneesi, edistää kasvaimen etäpesäkkeitä indusoimalla kasvua uusien imusuonten sisällä kasvain ja tehostamalla solujen kaupan imusolmukkeisiin. Lisäksi lisääntynyt imusuonitiheys kasvaimissa liittyy lisääntyneeseen etäpesäkkeeseen imusolmukkeisiin. . Siksi arvioimme imusuonen muodostumista homologue imusuonen hyaluronaani (LYVE-1) immunosäiliöiden shluc ja shp16 hiirten kasvaimia. Havaitsimme, että P16 tukahduttaminen johti alhaisempaan imusuonitiheyteen HPV/p16 positiivisissa ksenografteissa, mikä viittaa P16: n kaksoisrooliin etäpesäkkeissä (Kuva. 2b).
P16: n toiminnan ymmärtämiseksi keskityimme integriineihin, sillä nämä proteiinit hyväksytään angiogeneesin ja lymfangiogeneesin keskeisiksi säätelijöiksi . Lisäksi p16: n sitoutuminen integriineihin ja solujen leviämisen häviäminen on aiemmin dokumentoitu . Integriinit kuten alpha4 beta1 ovat tärkeitä lymfangiogeneesin modulaattoreita . Siksi arvioimme alpha4 beta1 integriinin esiintymisen SCC154 shluc-ja SCC154 shp16-hiirten kasvaimissa. Although not statistically significant (p = 0.09), shluc tumors showed a higher percentage of integrin compared to shp16 tumors (Fig. 2c). In line with SCC154 shRNA xenografts, tumors from HPV/p16 positive SCC154 xenografts showed higher percentage of alpha4 beta 1 integrin compared to tumors from HPV/p16 negative SQD9 xenografts (Fig. 2d).