bakteriofagit, joita kutsutaan myös Fageiksi, ovat viruksia, jotka nimenomaan infektoivat bakteereja. Bakteriofagit tartuttavat herkät isäntänsä kiinnittymällä ensin bakteerin soluseinään ja ruiskuttamalla geenimateriaaliaan. Sitten ne kaappaavat solun biosynteettisen koneen monistaakseen DNA: nsa ja tuottaakseen lukuisia jälkeläisfaagihiukkasia, jotka ne sitten vapauttavat lyseyttämällä ja tappamalla isäntäsolun.

tämä Lyytinen aktiivisuus on perustana laajalti käytetylle faagien luettelointitekniikalle, jota kutsutaan plakkimääritykseksi tai double agar layer-määritykseksi. Tässä bakteriofagiseos valmistetaan ensin sulassa ravinneliemessä, jossa on alhainen agar-pitoisuus. Kaikkien yhdistelmässä käytettävien bakteerien tulisi olla elossa ja aktiivisesti jakautumassa kasvunsa lokivaiheessa, mikä varmistaa, että suuri osa bakteereista on elinkelpoisia ja pystyy muodostamaan tiheän nurmikon plakkien ympärille. Seuraavaksi tämä sula bakteerifaagiseos levitetään kiinteämmälle, tiivistetylle agar-ravintoainealustalle, joka on jo jähmettynyt petrimaljaan. Huoneenlämmössä inkuboitaessa myös pieni agar-fagi-bakteeriliemi jähmettyy pehmeäksi agar-päällykseksi.

tässä bakteerisolut voivat saada lisää ravinteita pohjakerroksesta ja niiden pitäisi lisääntyä nopeasti, jotta bakteereista muodostuisi yhtenäinen nurmikko. Koska faagihiukkasia on kuitenkin myös pehmeässä kerroksessa, nämä infektoivat ja monistavat geneettisen materiaalinsa bakteerien sisällä, mikä huipentuu solulyysiin, joka vapauttaa useita jälkeläisiä. Nämä faagit infektoivat sitten naapurisoluja, sillä bakteerifaagikerroksen puolikiinteä olomuoto rajoittaa niiden liikkumista kaukaisempiin isäntäsoluihin. Tämä sykli infektio ja hajoaminen jatkuu useita kierroksia, tappaa suuren määrän bakteereja paikallisella alueella. Vaikutus naapurisolut tuhoutuvat, on tuottaa yhden ympyrän selkeä vyöhyke, kutsutaan plakki, joka voidaan nähdä paljain silmin, tehokkaasti vahvistaa bakteerien lyyttistä toimintaa fagi ja mahdollistaa niiden lukumäärän.

petrimaljassa olevien plakkien lukumäärää kutsutaan plakkia muodostaviksi yksiköiksi tai PFUs-yksiköiksi, ja jos alkuperäinen bakteriofagipitoisuus oli riittävän laimea, sen olisi vastattava suoraan infektoivien faagihiukkasten määrää alkuperäisessä näytteessä. Tätä tekniikkaa voidaan käyttää myös plakin morfologian karakterisointiin, faagityyppien tunnistamiseen tai faagimutanttien eristämiseen. Tässä laboratoriossa opit suorittamaan plakkimäärityksen fagien luetteloimiseksi Käyttäen esimerkkinä E. colin T7-faagia.

ensin määritetään sopiva viljelyaine isäntäbakteerisolujen ja bakteriofagin viljelyyn. Täällä lysogeny-lientä eli lb-mediumia käytettiin E. coli-bakteerin ja T7-faasin viljelyyn. Ota seuraavaksi kolme puhdasta lasipulloa ja merkitse ne medialla, nimi ja sitten ensimmäinen lb-liemenä, toinen lb-pohja-Agarina ja kolmas lb-Top-Agarina. Punnitse nyt neljä grammaa valmiiksi muotoiltua LB-jauhetta kolmena sarjana ja siirrä sitten yksi sarja punnittuja kuivattuja väliaineita jokaiseen pulloon. Lisää ensimmäiseen pulloon 200 millilitraa vettä. Sekoita sisältö magneettisekoittimella.

tämän jälkeen lisätään natriumhydroksidia tai kloorivetyhappoa käyttäen pH-mittaria ja koko ajan sekoittaen lopullinen pH arvoon 7, 4. Toista veden lisäys ja pH: n säätö myös kahdelle muulle jäljellä olevalle pullolle. Punnitse nyt kolme grammaa agar-jauhetta ja lisää se toiseen pulloon 1,5-prosenttiseksi pohja-agariksi. Lopuksi punnitaan 1. 2 grammaa agaria ja lisää se kolmanteen pulloon .6% LB top agar. Liemikunto ykköspullossa ei tarvitse agar-lisäystä. Sulje pullo puolitiiviisti ja steriloi sitten väliaine autoklavoimalla 121 asteessa 20 minuutin ajan. Kun pakkaus on valmis, poista väliainepullot autoklaavista ja kierrä välittömästi pullon korkit sulkemaan ne kokonaan kontaminaation estämiseksi. Pidä lb-liemi ja LB-Top Agar media penkillä myöhempää käyttöä varten. Aseta LB-pohja-Agar jäähtymään vesihauteeseen, joka on esiasetettu noin 45 asteeseen.

kun LB-pohja-agar saavuttaa noin 45 astetta, siirrä se työpenkkiin. Seuraavaksi steriloidaan työtila käyttäen 70 % etanolia. Seuraavaksi lisätään 450 mikrolitraa steriiliä yhden moolin kalsiumkloridia sulaan pohja-agariin, jolloin lopullinen pitoisuus on 2.25 millimolaarista. Pyörittele pulloa varovasti sekoittumaan. Aseta sitten seitsemän puhdasta petrimaljaa. Merkitse jokaisen lautasen pohjalle median nimi ja valmistuspäivä. Kaada sitten 15 millilitraa pohja-agaria kuhunkin seitsemään petrimaljaan. Anna levyjen vaikuttaa muutama tunti tai yön yli huoneenlämmössä. Kun viljelylevyt on asetettu, niitä voidaan tarvittaessa säilyttää neljässä asteessa useita päiviä ylösalaisin tiivistymisen minimoimiseksi. Siirretään Petrimaljat neljän celsiusasteen jääkaapista 37-asteiseen inkubaattoriin tuntia ennen määritystä.

määritystä edeltävänä päivänä E. coli-bakteeria viljellään. Täällä 10 mikrolitraa E. coli-viljelmää rokotettiin 10 millilitraan LB-lientä. Laita bakteerit kasvamaan yön yli ravistavassa inkubaattorissa, joka on asetettu 37 asteeseen 160 RPM: n kierrosnopeudella. Sitten määrityspäivänä poistetaan bakteeriviljelmä inkubaattorista. Siemen tuoretta 10 millilitraa tuoretta LB liemi 0,5 millilitraa yön kulttuuria. Aseta nämä solut kasvamaan ravistelevaksi inkubaattoriksi, jonka lämpötila on 37 celsiusastetta 160 RPM: ssä. Seuraavaksi tarkistetaan spektrofotometrin avulla, milloin tämä viljelmä saavuttaa log-faasikasvun, jonka optinen tiheys on 0,5-0,7. Kun OD saavuttaa tämän tason, lopeta inkubaatio siirtämällä soluviljelmä penkkiin. Ne ovat nyt valmiita käytettäväksi phage overlay-määrityksessä.

Faagititterit voivat vaihdella eksponentiaalisesti eri faagityypeissä ja näytteissä. Jotta ne voitaisiin laskea tehokkaasti, ne on laimennettava tuottamaan monenlaisia faagipitoisuuksia. 10-kertaisen laimennustekniikan jälkeen tehdään määrityspäivänä sarja faagilaimennoksia, joiden pitoisuudet vaihtelevat kymmenes-miljoonasosasta. Tilastollisesti merkitsevien ja tarkkojen tietojen saamiseksi suoritetaan sarjalaimennus kolmena kappaleena.

sulata seuraavaksi jähmettynyt lb-top-agar mikroaaltouunin avulla. Laita se sitten vesihauteeseen, joka on valmiiksi 45 asteessa tunnin ajan. Tunnin kuluttua kerätään pohja-agarikerroksen sisältävät Petrimaljat inkubaattorista. Levyt merkitään faagipitoisuudella ja määrityspäivämäärällä. Aseta sitten seitsemän puhdasta koeputkea. Merkitään jokaiseen koeputkeen Sarjanumero faagilaimennusnumerolla ja nimetään yksi kontrolliksi.

kun LB-top-agar saavuttaa 45 celsiusasteen, siirrä se työpenkille. Lisätään 450 mikrolitraa yhtä molaarista kalsiumkloridia 200 millilitran agariin, jotta lopullinen pitoisuus on 2,25 millimolaarinen. Pyörittele pulloa varovasti sekoittumaan. Seuraavaksi lisätään steriiliin kartiomaiseen putkeen 35 millilitraa LB-top-agaria ja neljä millilitraa bakteerisuspensiota. Pyörittele varovasti, jotta solut jakaantuvat tasaisesti, mutta vältä ravistamista vaahtoamisen estämiseksi.

nyt määräosa viisi millilitraa tätä bakteeripääagariseosta jokaiseen seitsemään koeputkeen. Tämän jälkeen siirretään 100 mikrolitraa sarjalaimennettua bakteriofaginäytettä ja kontrolliväliainetta, jonka pitäisi olla yksinkertaisesti väliainetta, jossa ei ole bakteriofagia, kunnioittavasti merkittyihin koeputkiin. Pyörittele seosta kevyesti oikean sekoittumisen varmistamiseksi. Siirrä varovasti viisi millilitraa bakteriofagiseosta vastaavalle Petri-levylle. Levitä seos tasaisesti koko pinnalle pyörittelemällä varovasti Petri-levyä.

kun kaikki Petrilevyt on kerrostettu seokseen, pintakerroksen jähmettymisen annetaan tapahtua inkuboimalla huoneenlämmössä 15 minuuttia. Kun nämä vaiheet on suoritettu, toistetaan toinen ja sitten kolmas petrimalja-sarja käyttäen kahta jäljellä olevaa faagilaimennossarjaa. Sulje jokainen vuoka parafilmillä ja inkuboi huoneenlämmössä 15 minuuttia. Viljelylevy asetetaan ylösalaisin sopivaan lämpötilaan 24 tunniksi tai kunnes laatat kehittyvät. Siellä levyt laitettiin 37-asteiseen inkubaattoriin yhdeksi päiväksi, mikä oli E: lle piristävä kasvuolosuhde. kolibakteeri ja T7-faagi.

plakit ilmaantuvat yhdestä viiteen päivän inkubaation jälkeen riippuen bakteerilajista, inkubaatio-olosuhteista ja kasvualustan valinnasta. Täällä plakkeja näkyi yhden päivän haudonnan jälkeen 37 asteessa. Aloita tarkastamalla rekisterimerkityt kilvet ja varmista, ettei niihin ole muodostunut laattoja, koska tämä viittaisi viruksen saastumiseen. Alkuperäisen näytteen faagititterin määrittämiseksi aloitetaan levyistä, jotka sisältävät laimennetuimman faaginäytteen, ja lasketaan kilvet ilman, että kannet poistetaan, merkitsemällä ne osoittamaan, mitkä niistä on jo laskettu. Toista laskenta jokaisen levyn jokaisessa sarjassa. Joissakin kilvissä voi olla liian monta tai liian vähän laattoja laskettavaksi. 10 – 150 on ihanteellinen plakin määrä.

luo seuraavaksi taulukko, jossa luetellaan plakin lukuarvot eri laimennoksille ja rinnakkaisnäytteille. Tämän jälkeen lasketaan keskimääräiset plakin lukuarvot laimennuslevyille, jotka sisälsivät ihanteellisen määrän plakkia. Tässä esimerkissä nämä olivat 10: stä miinus kolmeen ja 10: stä miinus neljään laimennuslevyyn muodostuneiden plakkien keskimääräinen lukumäärä. Nyt säädetään faagilaimennuskerrointa jakamalla saadut keskimääräiset plakkiarvot vastaavilla faagilaimennuskertoimilla. Tässä 10: stä miinus kolmeen ja 10: stä miinus neljään laimennuslevyyn muodostuneiden plakkien keskimääräinen lukumäärä jaettiin niiden laimennuskertoimilla, jotta saatiin plakkien muodostusyksiköiden eli PFUs: ien Määrä 100 mikroliterissä faagiseosta. Jotta arvo muunnettaisiin PFU: ksi millilitraa kohti, kerrottaisiin luodut arvot 10: llä, koska bakteriofagien peittovalmistusvaiheessa käytettiin vain 100 mikrolitraa faagilaimennosseosta, jolloin saatiin ylimääräinen laimennuskerroin 10. Lopuksi lasketaan eri laimennuslevyistä saatujen arvojen keskiarvo. Näin saadaan PFUs: ien keskimääräinen määrä millilitrassa. PFUs-yhdisteiden määrä vastaa infektiivisten faagihiukkasten määrää alkuperäisessä näytteessä.