4.2. 1 polymeraasi II

vaikka transkription päättämistä on tutkittu paljon vähemmän kuin sen aloittamista, viimeisten 25 vuoden aikana on käynyt ilmi, että orastavien transkription ja RNA-polymeraasien hyvin ajoitettu ja tarkka vapautuminen DNA-mallista on ratkaisevan tärkeää RNA: n kohtalolle sekä genomin kokonaishuollolle.

kuva 7.2. Rat1: n toiminta transkription lopettamisen torpedomekanismissa. (A) orastava Pol II mRNA-transkriptio pilkkoutuu cotranscriptionally pilkkomisen ja polyadenylaatiospesifisen tekijän (cpsf) Ysh1-komponentin avulla. Tuloksena saatu altistunut monofosforyloitu 5 ’ – loppuinen RNA on substraatti Rat1/Rai1: n nopealle hajoamiselle, sillä Rat1 / Rai1 oli kulkeutunut Pol II-kompleksiin Pcf11-ja Rtt103-proteiinien välityksellä, jotka ovat vuorovaikutuksessa Ser2-fosforyloidun CTD: n kanssa. Venymäkompleksi horjuu, kun Rat1/Rai1 saavuttaa polymeraasin. Rat1-riippuvaista lopettamista edistää sen1-helikaasi, joka on vuorovaikutuksessa rpb1: n suuren Pol II-alayksikön kanssa ja helpottaa Rat1: n rekrytointia. (B) Uusi syntetisoitu pre-rRNA pilkkoutuu cotranscriptionally rnt1-endonukleaasilla ja tuloksena oleva 3’ – tuote hajoaa rat1/Rai1: llä, mikä torpedoi Pol I: n.tehokas Pol I-terminaatio edellyttää myös nsi1: n ja/tai Reb1: n sitomista T1-terminaattorissa (vihreä laatikko) aiheuttaen polymeraasin pysähtymisen, Pol I-spesifisen alayksikön Rpa12: n ja helikaasin Sen1: n, joka liittyy rnna: han ja on suoraan vuorovaikutuksessa Rnt1: n kanssa. (KS. värilevyosio kirjan takasivulla.) Tehokas Pol I-terminaatio edellyttää myös nsi1: n ja/tai Reb1: n sitomista T1-terminaattoriin (vihreä laatikko), mikä aiheuttaa polymeraasin pysähtymisen, Pol I-spesifisen alayksikön Rpa12: n ja helicase Sen1: n, joka liittyy rDNA: han ja on suoraan vuorovaikutuksessa rnt1: n kanssa.

myöhemmät tutkimukset osoittivat, että hiivan Rat1 ja ihmisen Xrn2 olivat vastuussa torpedotoiminnasta ja että jommankumman entsyymin, samoin kuin hiivan rat1-aktivaattorin Rai1: n puute, johtaa lopetusvirheeseen, joka ilmenee laajana transkriptiolukuna. On myös mahdollista, että kasvi Rat1 homologue, Arabidopsis AtXRN3, toimii transkription päättymistekijänä samalla tavalla kuin Rat1/Xrn2. Suuren suoritustehon lähestymistavat paljastivat kertymisen mRNA-ja microRNA (miRNA)-geenien 3′ – loppuisista transkripteista xrn3 knockdown-mutantissa, joka voi vastata transkriptiomolekyylejä . Näin AtXRN3 voi osallistua maailmanlaajuiseen RNA 3′-loppuiseen valvontaan torpedoseisontatoimintansa seurauksena.

torpedomekanismi riippuu rat1: n eksonukleaasikatalyyttisestä aktiivisuudesta, eikä pelkästään sen läsnäolosta . Monofosforyloitu RNA-substraatti rat1/Xrn2: lle mRNA-synteesin aikana syntyy mRNA 3′ – päätteisen muodostuskoneiston polyadenylaatiokohdassa tapahtuvan cotranscriptionaalisen pilkkoutumisen (CoTC) seurauksena. Tarkemmin sanottuna tämän prosessin suorittaa CF II: n ysh1-komponentti hiivassa tai vastaava cpsf-73-alayksikkö ihmisen pilkkoutumiseen ja polyadenylaatioon liittyvässä spesifisyystekijässä (cpsf) (tarkasteltu ref. ). Tehokkaaseen irtisanomiseen ehdotettiin kahta tekijää: poly(A) – signaalin voimakkuus ja 5′ – pilkkoutumistuotetta hajottavan eksonukleaasin toiminta, mikä helpottaa polymeraasin pysähtymistä Poly(A) – kohdan alavirtaan ja edistää sen vapautumista . Toisaalta heikentynyt Rat1-riippuvainen terminaatio ei poista asianmukaista poly(a)-sivuston tunnistusta ja mRNA-pilkkoutumista .

rat1 / Xrn2: n lisää antokohtia voi syntyä nisäkkäiden Poly(A) – kohdan alajuoksulla tapahtuvassa Autokatalyyttisessä CoTC: ssä tai hiivan endonukleolyyttisessä pilkkoutumisessa rnt1: llä . Jälkimmäinen tapaus raportoitiin vikaturvallisena päättymismekanismina proteiinia koodaaville geeneille, jotka yhdessä Nrd1/Nab3/Sen1-kompleksin (NRD) välittämän reitin kanssa tarjoavat varatilan Pol II: n vapautumiselle.

vaikka rat1 / Xrn2 tarvitaan tehokkaaseen Pol II-terminaatioon, Rat1 ei laukaise terminaatiota in vitro eikä sen 5′ – 3′ – hajoamisaktiivisuus riitä edistämään polymeraasidissosiaatiota in vivo. Tumaan suunnattu hiivan Xrn1 kykenee johdonmukaisesti orastavan RNA: n cotranscriptionaaliseen hajoamiseen, mutta se ei pelasta rat1: n puutoksesta johtuvia päättymishäiriöitä. Nämä havainnot viittaavat siihen, että eksonukleaasi saavuttaa polymeraasin, mutta ei riitä horjuttamaan venymäkompleksia, ja että torpedomekanismin lisäosa toimii laukaisun aikana. On oletettu, että rat1: n ainutlaatuinen ominaisuus, extended tower domain, jota ei ole Xrn1-proteiineissa, saattaa olla vastuussa sen päättymisominaisuuksista . On mahdollista, että tower domain käy läpi tiettyjä muutoksia tai toimii rajapintana vuorovaikutuksille terminaatiota parantavien tekijöiden kanssa. Yksi mahdollinen ehdokas tekijäksi, joka stimuloi Rat1-riippuvaista terminaatiota, on RNA-helikaasi Sen1, joka on hiivan koodaamattoman RNA: n terminaatioreitin keskeinen osa (KS .alla), joka myös edistää proteiinia koodaavien geenien päättymistä, mikä vaikuttaa voimakkaimmin lyhyempiin MRN: iin. Sen1 on vuorovaikutuksessa n-terminaalisen verkkotunnuksensa kautta suurimman Pol II-alayksikön, Rpb1: n, kanssa ja heikentävä Sen1-helikaasiaktiivisuus heikentää genomin laajuista Pol II-jakautumista koodaavien ja koodaamattomien geenien kautta . Ihmisen Sen1-homologue, Senataksiini, osoitti suoraan edistävän Xrn2-välitteistä transkription päättymistä ratkaisemalla venyvän Pol II: n taakse muodostuneet RNA: DNA-hybridit (R-silmukat), pääasiassa g-rikkailla taukopaikoilla Poly(A) – kohdan alajuoksulla . Tämä toiminta helpottaa Xrn2: n pääsyä Poly(a) – sivuston 3 pilkkoutumistuotteisiin ja edistää siten torpedoeksonukleaasin aktivoitumista. Hiivan sen1 vaikutustavan arvellaan olevan samankaltainen .

vastausta vaille jäänyt kysymys on, miten Rat1 värvätään venyvään polymeraasiin. Useat havainnot tukevat Rat1-assosiaatiota Pol II: n C-terminaalisen domeenin (CTD) kanssa vuorovaikutuksessa olevien proteiinien kautta niiden CTD-interacting-domeenin (CID) kautta, joita ovat hiivan pilkkoutumistekijän IA (CFIA) pcf11-alayksikkö ja Rtt103 (ty1-transposition 103 säätelijä). Rat1 ja Rai1 ovat läsnä promoottorit ja koodaus alueilla, joilla on voimakas rikastuminen 3′-päissä geenejä. Rat1: n ja Pcf11: n välisen toiminnallisen vuorovaikutuksen on osoitettu helpottavan molempien tekijöiden molemminpuolista yhtymistä: Rat1 yhdistää päättymisen 3′-end-muodostumiseen stimuloimalla 3′ – end-prosessointitekijöiden, erityisesti CFIA: n alayksiköiden Pcf11 ja Rna15, rekrytointia, kun taas Pcf11 edistää Rat1: n assosioitumista poly(a) – sivuston suhteen . Myös ihmisen Pcf11: n osoitettiin lisäävän orastavan RNA: n hajoamista ja edistävän transkription lopettamista . Vastaavasti Rtt103, joka myös yhdistää lähellä 3 ’ – päistä geenejä, kopuroituu Rat1: n, Rai1: n ja Pcf11: n kanssa ja tunnistaa yhdessä Pcf11: n kanssa venyvän Pol II: n Ser2-fosforyloidun CTD: n . Toisaalta Rat1: n jakautuminen geeneihin ei muutu Rtt103: n puuttuessa . Lisäksi Rat1 lopettaa myös Pol I: n transkription, josta puuttuu CTD, mikä viittaa siihen, että Rat1: n rekrytointi voi tapahtua myös muiden mekanismien kautta. Hxrn2: n assosiaation ilmoitettiin välittyvän p54nrb/PFS (proteiiniin liittyvä silmukointitekijä), jotka ovat transkriptioon, silmukointiin ja polyadenylaatioon osallistuvia monikäyttöisiä proteiineja . P54nrb/PFS: n rooli Pol II-transkription lopettamisessa osoitettiin myös C. elegansilla.

Mrnas: n lisäksi Pol II syntetisoi laajan valikoiman koodaamattomia transkriptejä, mukaan lukien pienet ydinrnat ja snornat sekä erilaisia epästabiileja Rnat. Hiivassa näiden suhteellisen lyhyiden lajien transkriptio päättyy pääasiassa vaihtoehtoiseen NRD-kompleksiin, joka koostuu RNA: ta sitovista proteiineista Nrd1 ja Nab3 sekä ATP: stä riippuvaisesta helikaasista Sen1 . Koska tähän mekanismiin ei todennäköisesti liity cotranscriptionaalista endonukleolyyttistä pilkkoutumista, sen1-RNA: DNA-hybridin purkautumista pidetään välttämättömänä polymeraasidissosiaatiolle, kenties samalla tavalla kuin bakteerien Rho–DNA-RNA-helikaasi. Rho todennäköisesti epävakauttaa venymäkompleksia translokaatiolla ja poistamalla polymeraasista orastavaa RNA: ta . Vaihtoehtoisessa allosteerisessa mallissa Rho kuormittuu polymeraasille ja indusoi entsyymin aktiivisen kohdan uudelleenjärjestelyjä päättymiskohdassa . Molemmat toimintatavat voivat hyvinkin koskea Sen1-helikaasia.

vaikka Rat1 on värvätty snoRNA-geeneihin, erityisesti intronisiin geeneihin, SNORNA-transkriptien NRD-riippuva päättyminen ei ole heikentynyt, kun se puuttuu, ja siksi on esitetty, että se osallistuu joihinkin ennenaikaisiin päättymistapahtumiin . On kuitenkin edelleen mahdollista, että Rat1-torpedomekanismi voi edistää snornojen, kuten U3: n tai snR40: n, transkription lopettamista, jonka 3′-loppuinen vapautuu Rnt1-pilkkoutumalla, joka altistaa jäljellä olevan orastavan transkription 5′ – loppuisen Rat1-hyökkäykselle .