Cytopathic effect (CPE): how do viruses get away with murder

virukset, by definition, are invisible to our eyes. Ne ovat nanorakenteita, jotka voivat tulla näkyviin vain elektronimikroskopian avulla, tekniikka, joka on aikaa vievää ja joka ei ole kaikkien käytettävissä. Tämän vuoksi virologin on löydettävä vaihtoehtoja voidakseen työskennellä ja tutkia kiinnostuksensa kohdetta. Käytännöllinen tapa” nähdä ” ja epäsuorasti mitata virustartunta on tarkastella viruksen solulle aiheuttamia vaurioita. Tämä kärsimys tai vaurio tunnetaan sytofaattisena vaikutuksena (CPE) ja sen mittausta käytetään laajalti virologian laboratorioissa ympäri maailmaa.

CPE on hyvin alkeellinen tapa ymmärtää, miten virus tarttuu soluun, mutta se ei tarkoita, että sitä käytettäisiin vain tieteellisessä perustutkimuksessa. CPEs-arvojen mittaaminen voi olla myös erittäin hyödyllinen lukema lääkeyrityksille ja diagnostisille laboratorioille.

mikä on viruksen aiheuttama sytofaattinen vaikutus?

virukset ovat loisia, jotka tarvitsevat isäntäsolun lisääntyäkseen. Kun ne ovat solun sisällä, ne kaappaavat solukoneiston tuottamaan omia proteiinejaan, nukleiinihappoa ja kalvoa (tarvittaessa).

koska viruksella on solutekijöitä, joita solu muuten käyttää, sen replikaatio voi muuttaa isäntäsolujen perustoimintoja tai jopa tuhota sen. Virustartunnasta johtuvia solumuutoksia tai muutoksia kutsutaan CPEs: iksi. Nämä ovat yleensä negatiivisia muutoksia, jotka voivat aiheuttaa rakenteellisia, metabolisia tai toiminnallisia muutoksia solussa, joka on tartunnan. Ajan myötä CPEs voi aiheuttaa viruksen (taudin) patologisia vaikutuksia.

klassisia esimerkkejä sytopaattisesta vaikutuksesta

tunnettu viruksen aiheuttama CPE on solukuolema (katso video kuolevasta solusta ). Monet virukset tappavat soluja joko lyysillä tai aiheuttamalla apoptoosin. Esimerkiksi HIV: n tiedetään tappavan CD4 + T-lymfosyyttejä, mikä on tärkein syy siihen, miksi tartunnan saaneet henkilöt muuttuvat immuunipuutteisiksi.

laboratoriossa helppo tapa tappaa hyttysen solulinja (kuten C6 / 36) tai Vero-solut on tartuttaa siihen jokin kuuluisa arbovirus, kuten Chikungunya, Dengue tai Zika. Muutaman päivän infektion jälkeen solut vain hajoavat aivan silmiesi edessä (Kuva. 1).

kuva 1 / Vero-soluissa oli zikavirus. 72 tunnin infektion jälkeen selkeä CPE näkyy solukuoleman aiheuttavan soluselvityksen yhteydessä.

toinen CPE-esimerkki on syncytian muodostuminen. Vaipallisten virusten infektoimat solut ilmentävät plasmakalvollaan virusproteiineja, joita virukset käyttävät välittämään fuusiota isäntäsolun kanssa. Kun nämä virusproteiinit sitoutuvat naapurisolujen pinnalla oleviin reseptoreihin, tapahtuu solujen ja solujen fuusio, mikä johtaa syncytian muodostumiseen (monitumainen jättisolu).

Respiratory syncytial virus (RSV) on suurin pienten lasten viruskeuhkokuumeen aiheuttaja. Nimensä se on saanut siitä, että se voi muodostaa syncytiaa soluviljelmässä, mutta huomattavan paljon myös tartunnan saaneiden potilaiden keuhkoissa.

CPE: hen liittyviä muutoksia solujen morfologiassa ovat myös kiinnittyneiden solujen pyöristäminen, irtoaminen ja / tai paakkuuntuminen. Tässä tapauksessa tartunnan saaneet solut pysyvät metabolisesti aktiivisina replikoidakseen virusta, mutta niiden tukiranka muuttuu. Morfologiset muutokset voidaan selittää infektion seurauksena syntyvällä pinnan adheesioproteiinien ilmentymisen alasäätelyllä. Esimerkiksi ebolaviruksen tiedetään aiheuttavan dramaattisia morfologisia muutoksia kiinnittyneissä soluissa vähentämällä integriini β1: n ilmentymistä.

tarvitsetteko todella niin paljon draamaa (kuolema, gigantismi, muodonmuutos), jotta sitä voidaan pitää CPE: nä? Ei. Solut voivat vain ”käyttäytyä” eri tavalla, kun tartunnan, mutta näyttävät samalta. Hienovaraisempia mutta silti selkeitä CPE-tyyppisiä muutoksia voivat olla kasvunopeuden/kinetiikan muutokset, tietyn metabolisen aktiivisuuden muutokset tai muutokset solujen toiminnassa. Niistä eri viruksia, jotka voivat aiheuttaa tämän tyyppisiä CPEs seisoo Zika-virus. Vuonna 2015 tämä hyttysten välittämä virus oli uutisissa, koska se aiheuttaa mikrokefaliaa, vakavaa neurologista vahinkoa, jolle on ominaista aivojen pienentynyt koko sikiöillä. Myöhemmin on kuvattu, että mikrokefalia on seurausta useista Zikan aiheuttamista sytopaattisista vaikutuksista hermosoluihin, kuten solujen liikakasvusta, kasvun rajoittumisesta, solusyklin säätelyhäiriöstä ja solukuolemasta. Pesäkemuodostusmääritystä käytettiin muun muassa sen selvittämiseen, mitkä eri Zika-proteiinit häiritsevät solujen proliferaatiota.

tutkijoille, jotka järjestelmällisesti vertailevat solulinjojen kasvukinetiikkaa, suosittelemme CytoSMART Omnia. Kinetic live-cell kuvantaminen koko-wells, käyttäen automatisoitu skannaus ja kuvan ompelemalla ohjelmisto. Kuva Full well levyt tunneista viikkoihin kerrallaan.

Sytopaattiset vaikutukset ovat seurausta viruksen ja isännän välisistä yhteisvaikutuksista

on tärkeää mainita, että CPE: tä ei määrittele vain virus, vaan myös isäntäsolu. Se riippuu siitä, kuinka sallivia solut ovat tartunnalle. Se on salliva solu, joka voi tukea viruksen kasvua. Toisin sanoen kaikki virukset eivät voi tartuttaa kaikkia solutyyppejä. Yksinkertaistettuna voidaan sanoa, että:

• ei – salliva soluvirus ei voi infektoida
• salliva soluvirus voi replikoitua, mutta ei aiheuta ilmeistä CPE: tä
• erittäin salliva soluvirus replikoituu ja indusoi ilmeisen CPE: n

joten jos lisäät viruksen soluihisi eikä mitään tapahdu, älä huoli. Sinun täytyy vain löytää oikea virus-solu-yhdistelmä.

Readouts-How to measure CPE?

viruksen aiheuttamat solumuutokset, kuten solukuolema tai morfologian muutokset, näkyvät valomikroskopialla. Voit laittaa lautasesi ylösalaisin olevan mikroskoopin alle ja katsoa, kuolivatko solusi vai muuttuivatko ne. Myönteistä tässä lähestymistavassa on, että se on ”helppoa”, koska se ei vaadi näytteen käsittelyä, jolloin vältetään kiinnittyminen tai värjäytyminen artefakteja.

varjopuolena on, että se on laadullinen eikä määrällinen, ja se nojaa vahvasti tarkkailijan koulutukseen. Nykyään tämä lähestymistapa voidaan automatisoida tekemällä reaaliaikainen seuranta viruksen aiheuttama sytopatogeneesi. Esimerkiksi viruksen muutokset solujen leviämisessä ja lisääntymisessä voidaan arvioida haavan paranemistestillä, jossa voidaan havaita kollektiivisen ja yksisoluisen siirtymisnopeuden väheneminen sekä vakavat muutokset solun morfologiassa. Toinen kvantitatiivinen lähestymistapa on solujen proliferaation seuranta automatisoidulla kuva-analyysillä. Tällä tekniikalla on mahdollista tuottaa kasvukäyriä tartunnan vs. ei-infektoituneet soluviljelmät, joilla määritetään asianmukaisesti virustartunnan mahdollinen sytopaattinen vaikutus.

Jos kuolemansolut tekevät päivästäsi sen, vaihtoehtona on kuuluisa Plakkimääritys. Tätä klassista virologista tekniikkaa käytetään tarttuvien viruspartikkelien kvantifiointiin, ja se perustuu periaatteeseen, että virukset voivat aiheuttaa solujen hajoamista. Kun solut ovat tarttuneet erittäin sallivista soluista koostuvaan yksikerroksiseen soluun, niiden vastapainona on kidevioletti (elävät solut ovat värillisiä, kuolinsolut pysyvät muuttumattomina), jolloin syntyy kauniita plakkeja (kuolinsolujen alueita), jotka voidaan helposti määrittää paljaalla silmällä.

mutta sinun ei tarvitse nähdä solujasi tietääksesi, että ne ovat kuolema. Solujen elinkelpoisuus infektion jälkeen voidaan mitata määrittämällä solunsisäinen ATP-pitoisuus firefly-luciferaasilla tai perinteisellä MTT-määrityksellä.

virusten kanssa työskentely voi olla vaivalloista, BSL-3/4-laboratorioissa on tiukat turvatoimet ja laboratorioon pääsy ja sieltä poistuminen vie paljon aikaa. Tutkijoille, jotka etsivät ratkaisua solujen seuraamiseen, ilman että heidän täytyy mennä laboratorioon, suosittelemme cytosmart Lux2 Duo-pakkausta.

Sovellukset

aiheuttaako viruksesi CPE: n? Voitko selvästi nähdä tai mitata sen? Hienoa! Voit käyttää tätä CPE: tä onnistuneen virusinfektion tai replikaation lukemana. Tietty CPE voi toimia indikaattorina selvittää, miten estää infektio, luonnehtia isäntä tai taudinaiheuttaja tekijöitä tarvitaan infektion tapahtua, tunnistaa viruksen tropismi, muun muassa. Käytännössä tämä tarkoittaa, että sitä voidaan käyttää seuraavasti:

• antiviraalisen yhdisteen seulonta ja arviointi
  Voiko lääkeaihio estää CPE: n muodostumista?
• neutraloivien vasta-aineiden seulonta
  Voiko tietty vasta-aine estää viruksen aiheuttamaa CPE: tä?
• viruslääkeresistenssin seuranta (fenotyypin määritys)
  Voiko tietty virus isolaatti indusoida CPE: tä viruslääkkeiden läsnä ollessa?
• viruksen tropismin Luonnehdinta
  mitkä solutyypit ovat ensisijaisesti viruksen infektoimia? Miksi? (Tarkista äskettäin julkaistu pahamaineinen SARS-CoV – 2 in.)
• virustautien diagnoosi
  tartuttaako virus aktiivisesti ihmistä? Onko kliininen näyte otettu kyseiseltä henkilöltä, joka indusoi CPE: tä? Pidetään mielessä, että useimmat diagnostiset menetelmät (ELISA, RT-qPCR) eivät havaitse tarttuvia viruspartikkeleita.

johtopäätökseksi…

vaikka virustartunnan mittaamiseen on useita tapoja, CPEs: n tarkistaminen sallivista soluista on edelleen yleisesti käytetty vaihtoehto. Jotta se olisi todella hyödyllinen, sinun täytyy löytää oikea yhdistelmä: virus, salliva solu ja tarkka lukema. Kun löydät tämän yhdistelmän, sovellukset voivat olla varsin monipuolisia ja hyödyllisiä joko akateemisessa ympäristössä, teollisuudessa tai kliinisessä diagnostiikassa.

Lue kaikki Sytosmart-kuvantamisratkaisut täältä