öt Pax-6 variáns és azok expressziós mintái tintahal embriókban és felnőtt szemszövetekben
egyetlen 3’fajú PCR-t hajtottunk végre a pigmeus tintahal Pax-6 gén (ippax-6-ként jelölve), hogy megvizsgáljuk a Pax-6 splicing variánsait és többszörös lokuszait coleoid lábasfejűek. Megállapítottuk, hogy a pigmeus tintahalban nem volt több lókusz, de három Pax-6 diszkrét hosszúságú változatot azonosítottunk. Az aminosav-szekvenciák különbségei ezen Pax – 6 variánsok között korlátozott régiókra korlátozódtak. Ezért feltételezték, hogy egyetlen lokusz alternatív splicing eseményeinek eredményei. Ezután RT-PCR-rel validáltuk a splicing variánsok jelenlétét, és végül ötféle splicing variánst kaptunk, köztük az autentikus Pax-6 látszólagos ortológusát (1.ábra). A hiteles IpPax-6 hossza és szerkezete hasonló volt a Pax-6 génekéhez, amelyeket más tintahalfajokban,az Euprymna scolopes-ban és a Loligo pealei15, 16-ban találtak. A hiteles IpPax-6 (hiteles forma, 499 aa) két független DNS-kötő domént, a PD és HD domént, valamint egy C-terminális P/S/T-ben gazdag domént (PST) tartalmaz, amely a partner transzaktivátor fehérjével rendelkező dedikált aktivátor, amint azt sok állat mutatja (1.ábra). Mind a fehérje szekvencia hasonlósága, mind a filogenetikai fa megerősítette, hogy az IpPax-6 a fly ey és a gerinces Pax-4/6 ortológusa volt (1.Kiegészítő ábra). A négy azonosított variáns olyan fehérjéket termelt, amelyek hossza eltér a hiteles IpPax-6-tól (1.ábra).
a pigmeus tintahalban található illesztési változatok diagramjai.
a felső sor a squid Pax-6 gén becsült exon-intron szerkezetét mutatja. A nyílhegy egy korábbi vizsgálatban, genomiális PCR analízissel igazolt intront mutat tintahal fajokban. A hiteles forma (499 aa) a leggyakoribb, hasonló a többi tintahalfaj Pax-6 génjéhez. Az 1.és 3. változatból hiányzik a 4. exon, amely a HD N-terminális felét kódolja. A 2.és 3. változatnak van egy további exonja, a 6. exon a PST tartományban. A 4-es változat egy további 3-as exont is mutat, amely 20 aminosavat kódol a PD és HD domének közötti linker régióban.
a squid Pax-6 variánsok szakaszspecifikus expressziójának feltárásához Q-PCR-t végeztünk különböző szövetekre és különböző embrionális szakaszokra olyan primerek alkalmazásával, amelyek célja az IpPax-6 további exonjainak megcélzása (2.ábra & S2 ábra). A tintahal tojás epibolikus gasztrulációt és közvetlen fejlődést mutat tipikus puhatestű lárvaállapotok nélkül17. Az embrionális szemek a blastodisc külső epidermájából jelennek meg, és a 18.stádium után differenciálhatók, a retina pigmentációja a 20. stádiumtól kezdődik. A lencse átlátszó, botszerű szerkezetként jelenik meg, amely szabad szemmel látható a 25.szakaszban. Először Q-PCR-t hajtottunk végre a 2.exont célzó primerek felhasználásával, amely mind az öt változatot lefedi. A Q-PCR analízis azt mutatta, hogy az IpPax-6 a 16. szakaszban expresszálódott a szem vezikulum képződése előtt (2a ábra). Az IpPax-6 expressziós intenzitását a tintahal embrió fejlődésével fokozatosan szabályozták (2a ábra), a szemgolyó a vizsgált szövetek között a legnagyobb expressziós intenzitást mutatta. Amint azt a többi bilateriai állatnál megfigyelték, az IpPax-6 hiteles és variáns formái az izomszövetben jelentősen depressziós szinten expresszálódtak. Ezután olyan primereket használtunk, amelyek a 4. exon nélküli variánsokat célozták meg (1.és 3. változat, 2b ábra). A primerek az 1-es és 3-as variánsokat alacsony szinten mutatták ki az embriókban a 16.stádiumban és a szemgolyó szövetében. Olyan primereket is használtunk, amelyek a 6.exont célozták meg (2. és 3. változat, 2C ábra). A Q-PCR analízis kimutatta, hogy a 2.és 3. variáns a szemgolyókban és az optikai lebenyekben, valamint az embriókban expresszálódott a 16. és 25. szakaszban. Mivel a fotoreceptor sejtek és a lencse kialakulása az embriókban a 25. stádiumban kezdődik, a variánsok, beleértve a 6.exont is, hozzájárulhatnak a szem fejlődéséhez. Az eredmények azt mutatják, hogy az IpPax-6 változatok expressziós mintái jelentősen eltértek a hiteles IpPax-6-tól.
a pigmeus tintahal Pax-6 változatának kifejezése.
az összes IpPax-6 variáns (A), A 4.exon nélküli variáns (1. és 3. variáns) (B) és a 6. exont is tartalmazó variáns (2. és 3. variáns) (C) expressziós szintjét valós idejű RT-PCR analízissel számszerűsítettük. Az egyes testrészek expressziós szintjét a 16.szakaszhoz (1.0) viszonyítva kiszámítottuk, majd ezt követően az alfa-tubulin expressziós szintjére normalizáltuk. A számszerűsítéseket kétszer végeztük el egymástól függetlenül generált különböző cDNS-Eken, és kiszámítottuk a geometriai átlagokat. Az y tengely önkényes. A hibasávok standard eltéréseket jelentenek. (D–G) az IpPax-6 2.exon (D, F) és az IpPax-6 4. exon (E, G) anti-sense RNS-próbákkal végzett teljes In situ hibridizációs analízisek. Egy, a 2. exonból tervezett RNS-szonda, amely mind az öt variánst célozta meg, kimutatta a Pax-6 expresszióját az embriók agyterületén a 22. (D) és a 25. (F) szakaszban. A 2. exonból tervezett RNS-szonda a szem körüli Pax-6 expressziót is jelzi (D’, oldalnézet). A 4.exon célzási variánsaiból, valamint a 2. és 4. variánsból tervezett RNS-szonda hasonló expressziós mintákat mutatott (E, G), mint a 2. exont célzó szonda, kivéve a szem körüli szövetet (E). Ez az eredmény arra utal, hogy a 4.exon delécióval rendelkező variánsok (1. és 3. variánsok) specifikus lokalizációt mutatnak a szem körüli szövetben a többi variánshoz képest (nyílhegy). Skála sávok, 10 db.
hogy megkülönböztessük, mely változatok vannak jelen az egyes szakaszokban, RT-PCR-t hajtottunk végre primer készletek felhasználásával az exon határain keresztül. Az 1. változatot valamennyi/néhány embrionális szakaszban kifejezettnek tekintették, de a felnőtt szemekben nem (2. Kiegészítő ábra). Az RT-PCR analízis azt is kimutatta, hogy a 4-es variáns erősen expresszálódott a felnőtt szemekben, különösen a retinában, de a lencsékben nem (kiegészítő 2A ábra). A 2-es és 3-as variánsokat minden embrionális szakaszban, valamint a felnőtt szövetekben is kifejezték (2b.kiegészítő ábra).
az IpPax-6 variánsok szövetspecifikus expressziójának azonosításához in situ hibridizációt hajtottunk végre olyan RNS–szondákkal, amelyek kifejezetten az egyes variánsokhoz kötődnek (2D-G ábra). A 2. exonból tervezett RNS-szonda mind az ebben a tanulmányban azonosított öt variánst célozza meg. A 4.exonból tervezett RNS-szonda a hiteles formához, valamint a 2. és 4. változathoz kötődik. Az IpPax-6 az agy területén található, beleértve a hátsó bazális lebenyt, a felső frontális lebenyt, a kocsány/szagló lebenyeket és az optikai lebenyeket (2D–G ábra), amint azt Hartmann et al.18 a retinán kívüli Szövet (talán a jövőbeli iridofórrétegnek felel meg) szintén egyértelműen kifejezte az IpPax-6-ot a 22.szakaszban (2D és 2D’ábrák). Az IpPax – 6 expressziót ebben a rétegben a 25.szakaszig figyelték meg. A 4. exont célzó szonda in situ hibridizációja azt sugallta, hogy a 2.és 4. variáns hasonló expressziós mintázattal rendelkezik az agyban, de a szemben nem (2e ábra). Ez a megállapítás arra utal, hogy az 1.és 3. változat (a 4. exon hiányában) a szem külső rétegében van szabályozva. Ezek a következmények azt jelentik, hogy minden IpPax-6 változatot függetlenül szabályoznak a szemképződés folyamataiban.
A Pax-6 exon-intron szerkezete más lábasfejűeknél/puhatestűeknél
megvizsgáltuk, hogy az ilyen típusú alternatív illesztést csak a coleoid lábasfejűeknél szerezték-e meg. RT-PCR analízist alkalmazva japán lándzsás tintahal (Loligo bleekeri) embrionális RNS-ekre, háromféle mRNS-t találtunk, amelyek valószínűleg alternatív illesztésből származnak (4.exon kihagyás, 3. exon behelyezés és 6. exon behelyezés) a szemekben (3a, B ábra). A behelyezett 3.és 6. exon 20, illetve 40 aminosavat kódolt, míg a kihagyott 4. exon 51 aminosavat kódolt. Más puhatestű genomokban hasonló alternatív splicing jelenlétének felmérése céljából megvizsgáltuk a Pax-6 exon-intron szerkezetét a bagoly limpet és a gyöngy osztriga esetében. Az owl limpet (Lottia gigantea, a JGI genomportál Lotgi V1.0, e_gw1.86.103.1)19 és a gyöngy osztriga (Pinctada fucata, az OIST tengeri genomikai egység genomb böngésző P. fucata_ver1.0, átirat: pfu_aug1.0_8418.1_67856.t1, állvány8418.1) 20 azt mutatta, hogy a puhatestű Pax-6 öt exonnal rendelkezik. A tintahal 4. exonját a vizsgált puhatestű Fajok között konzerválták. A 3-as és 5-ös exonokat azonban nem találták meg a pearl oyster Pax-6 génben. Így azt találtuk, hogy a 2-es és 4-es variáns formákat a coleoid lábasfejűek törzsében szerezték meg (1.ábra).
a HD IpPax-6 változataiban és előrejelzett 3D struktúráiban található Indel-ek.
a pigmeus tintahal (a) 3.és (B) 6. exonjának egymáshoz igazított nukleotidszekvenciái, illetve a japán lándzsás tintahal. Az összehasonlító modellezésben használt HD transzlált aminosav-szekvenciáinak összehangolása (C). Az IpPax-6 1-es és 3-as változatából hiányzik az 1-es hélix egy része. A homológiai modellezéssel kapott spliced HD háromdimenziós szerkezete (D, D’). A zöld botok az IpPax-6 fehérjéit jelzik,a szürke golyók pedig a cél DNS-molekulákat. A pontozott kör az 1 hélix azon részét jelöli, amelyet a 4.exon törlése elvesztett.
legjobb tudásunk szerint tanulmányunk elsőként számolt be a squid Pax-6 kereten belüli illesztési változatairól, amelyeket az embrionális stádiumtól függően másképp fejeztek ki. Korábbi tanulmányok izoláltak diszkrét típusú splicing variánsokat, amelyek elvesztették a PD domén N-terminális felét más squid fajokban15, 18, de ezek a változatok nem mutattak tér-időbeli különbségeket az expresszióban. Tanulmányunk azt is javasolta, hogy a Pax-6 transzkriptumok variációinak alternatív illesztéssel történő megszerzésének mechanizmusait egyedülállóan szerezték meg a coleoid lábasfejűek törzsében, mivel az alsó puhatestűek, mint például a kagylók, nem rendelkeznek megfelelő exonszerű fragmenssel genomjukban.
a squid Pax-6 variánsok funkciója és feltételezett szerepük a szem fejlődésében
az alternatív módon használt exonokban kódolt aminosav-fragmens hozzáadása és törlése várhatóan szerkezeti változásokat okoz az IpPax-6 fehérje variánsokban, amelyek megváltoztathatják funkciójukat a fejlődési folyamatban. Két változata (1.és 3. változat) hiányzik a 153mer az autentikus Pax-6 közepén és a HD fele (1. ábra). Annak feltárására, hogy a deléció befolyásolja-e funkcionális tulajdonságaikat, összehasonlító modellezés alapján háromdimenziós (3D) szerkezeti előrejelzéseket végeztünk a fehérjékről. Az eredeti IpPax-6 HDs feltételezett 3D struktúráit, valamint a 3.exon által kódolt szegmens nélküli változatot alkották meg. A sablonszerkezetet DNS-hez kötött formában azonosítottuk, így meg tudtuk jósolni az IpPax-6 szerkezetét és a DNS-hez kötött változat szerkezetét. A hiteles forma feltételezett 3D szerkezete meglehetősen jól modellezett volt; a magmaradványokat, nevezetesen a HD első spirálja előtti hurkon lévő Phe-t, az első spirálon lévő Leu-t, a második spirálon lévő Leu-t, a modellszerkezet harmadik spirálján pedig a Trp-t és a Phe-t konzerválták, és a HD három spirálját látszólag szorosan egymásba csomagolták (3C ábra). A DNS-kötéshez fontos maradékok, nevezetesen két Arg-maradék az N-terminális karon és a poláris maradványok a harmadik hélix felületén, meglehetősen közel helyezkedtek el a DNS-interfészhez (3C, D ábra). A változat feltételezett 3D-s szerkezete azonban számos problémás kérdést mutatott be. A modellezett struktúrában a 3.exon által kódolt régió elvesztését, amely az első hélix N-terminális részét kódolja, 15, a 2. exonban kódolt maradék kompenzálta. Így a hiteles és variáns formák aminosav-szekvenciái csak az N-terminális oldal 15 maradékát tartalmazó régióban különböztek egymástól. Ez a különbség azonban jelentősen megnövelte a változat szerkezeti energiáját, és nyilvánvalóan destabilizálta a teljes szerkezetet. Ez az instabilitás abból eredhet, hogy az első hélix előtti hurkon nincs Phe, az első hélixen pedig Leu. Ezek az alkatrészek nyilvánvalóan fontosak a három spirál csomagolásához. Ezenkívül az N-terminális hurokban két Arg-maradék hiányzott, amelyek hiteles formában kötődnek a minor horony DNS-bázisaihoz. Ezek a Stabilitási és DNS-kötési problémák a variánsban erősen arra utalnak, hogy a variáns HD-je instabil, és hogy a doménnek kevés kötési affinitása van a DNS-hez (3D és 3D’ábrák). A stabil HD hiánya azt is sugallja, hogy az 1-es és 3-as variánsoknak más a DNS-célhelyük, mint az eredeti ippax-6-nak a tintahalfajokban.
két változat (2.és 3. változat) szintén 120 mer beillesztést mutatott a PST tartományon belül (1. ábra). A beillesztett szekvenciát a tintahalra specifikusnak találtuk (2.ábra). Ez a beillesztés megváltoztathatja a PST tartomány transz-aktiválási tevékenységeit. A 4-es változat egyedi beillesztést (57 mer) mutatott a PD és a HD között. A Motif program (http://www.genome.jp/tools/motif/) nem talált ismert tartományokat vagy aláírásokat a beillesztett sorrendben. Ez a beillesztés megnyújtja a linkert a PD és a HD tartományok között.