expedíció Dél-Amerikába
humboldtban nőtt a meggyőződés, hogy életének valódi célja a tudományos kutatás volt, és 1797-ben lemondott posztjáról, hogy nagy egyszemélyességgel alapos ismereteket szerezzen a geodéziai, meteorológiai és geomágneses mérések rendszereiről. A napóleoni háborúk által okozott politikai felfordulások megakadályozták számos tudományos expedíció megvalósítását, amelyekben Humboldt lehetőséget kapott a részvételre. Végül csalódottságától elkeseredve, de nem volt hajlandó elrettenteni szándékától, engedélyt kapott a spanyol kormánytól, hogy meglátogassa a spanyol gyarmatokat Közép-és Dél-Amerikában. Ezek a kolóniák csak a spanyol tisztviselők és a római katolikus misszió számára voltak elérhetők. Teljesen elzárva a külvilágtól, óriási lehetőségeket kínáltak egy tudományos felfedezőnek. Humboldt társadalmi helyzete biztosította a hivatalos körökbe való bejutást, Mariano De Urquijo spanyol miniszterelnökben pedig egy felvilágosult embert talált, aki támogatta a királyhoz benyújtott királyi engedély iránti kérelmét. 1799 nyarán útnak indult Marseille-ből aim Bonpland francia botanikus kíséretében, akivel Párizsban találkozott, akkor Európa legélénkebb Tudományos Központjában. Az anyja halálakor örökölt birtok lehetővé tette Humboldt számára, hogy teljes egészében saját zsebéből finanszírozza az expedíciót. Humboldt és Bonpland öt évet töltött 1799-től 1804-ig Közép-és Dél-Amerikában, több mint 6000 mérföldet (9650 km) gyalog, lóháton és kenuban. Ez volt az élet nagy fizikai megterhelés és súlyos nélkülözés.
Caracastól kezdve dél felé haladtak a gyepeken és a bozótosokon keresztül, amíg el nem értek az Apure partjához, az Orinoco folyó mellékfolyójához. Kenuval folytatták útjukat a folyón egészen az Orinocóig. A Casiquiare folyását követve bebizonyították, hogy a Casiquiare folyó kapcsolatot képez az Amazonas és az Orinoco hatalmas folyórendszerei között. Három hónapon át Humboldt és Bonpland sűrű trópusi erdőkön haladt át, amelyeket szúnyogfelhők kínoztak és a párás hő elfojtott. Élelmüket hamarosan elpusztították a rovarok és az eső; az élelem hiánya végül arra késztette őket, hogy földi vad kakaóbabokon és folyóvízen éljenek. Mégis, mindkét utazó, akiket az új és elsöprő benyomások által nyújtott izgalom feldobott, egészségesek és a legjobb hangulatban maradtak, amíg vissza nem tértek a civilizációba, amikor súlyos lázas küzdelemnek estek áldozatul.
rövid Kubai tartózkodás után Humboldt és Bonpland visszatért Dél-Amerikába az Andok kiterjedt feltárására. Bogot-tól a perui Trujillóig az Andok hegyvidékén vándoroltak—egy olyan útvonalat követve, amelyet ma a Pánamerikai autópálya halad át, korukban meredek, sziklás és gyakran nagyon keskeny ösvények sora. Számos csúcsot megmásztak, köztük az összes vulkánt Quito, Ecuador; Humboldt Chimborazo (20 702 láb ) emelkedése 19 286 láb (5878 méter) magasságig, de a csúcstól elmaradva közel 30 évig hegymászó világrekord maradt. Mindezeket az eredményeket modern Hegymászó felszerelések, kötelek, görcs vagy oxigénellátás nélkül hajtották végre; ezért Humboldt és Bonpland súlyosan szenvedett a hegyi betegségtől. De Humboldt előnyére fordította kellemetlenségét: ő lett az első ember, aki a hegyi betegséget az oxigénhiánynak tulajdonította a nagy magasságú ritka levegőben. Tanulmányozta a óceáni áramlat Dél-Amerika nyugati partjainál, amelyet eredetileg róla neveztek el, de ma Peru Áramlat néven ismert. Amikor a páros megérkezett quitóba, a tapasztalt hegymászó és a tudományos adatok fáradhatatlan Gyűjtője, Humboldtnak nem volt nehézsége az udvaronc és a világ emberének szerepét átvenni, amikor az alkirály és a spanyol társadalom vezetői fogadták.
1803 tavaszán a két utazó guayaquilból a Mexikói Acapulcóba hajózott, ahol expedíciójuk utolsó évét a spanyol gyarmatok legfejlettebb és legcivilizáltabb részének alapos tanulmányozásával töltötték. Rövid tartózkodás után az Egyesült Államokban, ahol Humboldt fogadta amerikai Pres. Thomas Jefferson, Franciaországba hajóztak.
Humboldt és Bonpland hatalmas mennyiségű információval tért vissza. Az új növények hatalmas gyűjteménye mellett meghatározták a hosszúságot és a szélességet, a Föld geomágneses mezőjének összetevőinek mérését, a hőmérséklet és a légköri nyomás napi megfigyelését, valamint statisztikai adatokat Mexikó társadalmi és gazdasági körülményeiről. Amikor Humboldt egy amerikai kereskedelmi központban találta magát, jelentéseket és másolatokat küldött gyűjteményeiből testvérének, Wilhelmnek, aki neves filológus lett, valamint Francia tudósoknak; sajnos a brit hajók által akkor kikényszerített kontinentális blokád megakadályozta postájának nagyobb részét abban, hogy elérje rendeltetési helyét.