az Euphrasia rostkoviana Hayne illóolaj összetétele és antimikrobiális aktivitása

absztrakt

Eyebright, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), egy gyógynövény, amelyet hagyományosan Európában használnak különböző egészségügyi rendellenességek kezelésére, különösen szemmosásként olyan szembetegségek kezelésére, mint a kötőhártya-gyulladás és a blepharitis, amelyek bakteriális fertőzésekkel társulhatnak. Néhány Euphrasia fajról korábban beszámoltak arról, hogy illóolajat tartalmaz. Az E. rostkoviana olaj összetétele és bioaktivitása azonban nem ismert. Ezért ebben a tanulmányban az eyebright illóolaj kémiai összetételét és antimikrobiális aktivitását vizsgáltuk néhány szemfertőzéssel összefüggő organizmussal szemben: Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Pseudomonas aeruginosa és Candida albicans. A GC-MS analízis több mint 70 összetevőt mutatott ki, fő összetevőként n-hexadekánsav (18,47%), majd timol (7,97%), mirisztinsav (4,71%), linalool (4,65%) és anetol (4,09%). Az illóolaj antimikrobiális hatást mutatott az összes vizsgált organizmussal szemben, a P. aeruginosa kivételével. A legjobb aktivitást az összes vizsgált Gram-pozitív baktériummal szemben figyelték meg, minimális gátló koncentrációjuk 512 GB/mL volt. Ez az első jelentés az E. rostkoviana illóolaj kémiai összetételéről és antimikrobiális aktivitásáról.

1. Bevezetés

Eyebright, Euphrasia rostkoviana Hayne (Scrophulariaceae), Európában évszázadok óta használják hagyományos gyógyszerként különböző betegségek kezelésére. A virágzó légi részek főzeteit és infúzióit száraz köhögés, rekedtség, hideg, fülfájás és fejfájás, szénanátha, gennyes bőrelváltozás vagy a bélrendszer holtági betegségei ellen használják, de különösen szemmosásként olyan szembetegségek kezelésére és megelőzésére, mint a kötőhártya-gyulladás, blepharitis, szemfáradtság, gennyes szemgyulladás és sties . Az eyebright tea használatáról az etnoveterináris gyógyászatban is beszámoltak tehén szemfertőzés kezelésére . Annak ellenére, hogy évszázadok óta használják a szembetegségek kezelésére, csak egy prospektív kohorsz vizsgálatot végeztek, amely megerősítette az Euphrasia szemcseppek hatékonyságát a kötőhártya-gyulladás kezelésében és egyetlen klinikai vizsgálatot, amely a szemcseppek helyi alkalmazásának hatását vizsgálja az újszülöttek antibiotikum-fogyasztására . Sőt, az Euphrasia-kivonatok antikandidális és antibakteriális aktivitásáról szóló legutóbbi jelentésekig az antimikrobiális hatás spektruma teljesen ismeretlen volt.

az e terápiás hatása. a rostkoviana elsősorban antioxidáns, gyulladáscsökkentő, antimikrobiális aktivitásának tulajdonítható . Az E. rostkoviana kivonatokban korábban azonosított vegyületek közül az apigenin , a luteolin, a kaempferol, a kvercetin, a koffeinsav, a kumarinsav és a rozmarinsav felelős az antimikrobiális hatásért. Bár az E. officinalis L. és az E. stricta Kunt illóolaj (eo) jelenlétéről korábban beszámoltak, az E. rostkoviana eo összetétele és bioaktivitása nem ismert. Ezért ebben a tanulmányban megvizsgáltuk a eyebright eo kémiai összetételét és antimikrobiális aktivitását három Gram-pozitív baktérium (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus és S. epidermidis), három Gram-negatív baktérium (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae és Pseudomonas aeruginosa), valamint egy élesztő (Candida albicans), a szemfertőzésekkel gyakran összefüggő organizmusok ellen.

2. Anyag és módszerek

2.1. Vegyszerek és növényi anyagok

A Sigma-Aldrich-től (Prága, Csehország) vásárolták a borneol, kámfor, karvakrol, karvone, kariofillén, p-cymene, estragole, eukaliptol, limonene, linalool, mentol, Menton, antioxidánsok és a ciprofloxacin, valamint a tiokonazol elleni kontroll antibiotikumokat. Oldószerként hexánt (Merck, Prága, Csehország), dimetil-szulfoxidot (DMSO) (Lach-Ner, Neratovice, Csehország) és Tween 80-at (Sigma-Aldrich, Prága, Csehország) használtak. Az EO lepárlásához használt növényi anyagot kereskedelmi forrásokból vásárolták (F-DENTAL, Hodon, Cseh Köztársaság). Az EO-t hidrodesztillációval extraháltuk Clevenger típusú készülék.

2.2. Az EO kémiai analízise gázkromatográfia-tömegspektrometriával (GC-MS)

az E. rostkoviana EO-t GC-MS-vel elemeztük Agilent 7890A GC alkalmazásával, az Agilent 5975c EGYVADRUPÓLUSÚ tömegdetektorhoz csatolva, amely az Agilent (Santa Clara, CA, USA) HP-5ms oszlopával (30 m 0,25 mm, 0,25 KB film) volt felszerelve. Hexánt használtunk oldószerként, és a mintamennyiséget 1-es mintamennyiséget injektáltunk osztott módban (20 : 1 arány) az injektorba, amelyet 250-re melegítettünk) C. a kiindulási sütő hőmérsékletét 60 cc-ra állítottuk be 3 percig, 230 cc-ra programozva 3 cc/perc sebességgel, majd 10 percig állandó értéken tartottuk. Héliumot használtunk vivőgázként 1 mL/perc áramlási sebességgel. Az MS analízist teljes szkennelési módban végeztük, és az elektronionizációs energiát 70 eV-ra állítottuk be. Az egyes komponensek azonosítása tömegspektrumuk és relatív retenciós indexeik összehasonlításán alapult a Nemzeti Szabványügyi és Technológiai Intézet könyvtárával (NIST, USA) és irodalmával , valamint a hiteles szabvány befecskendezésén.

2.3. Baktériumtörzsek és táptalajok

három Gram-pozitív baktérium standard törzsei Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213 és S. epidermidis ATCC 12228, három Gram-negatív baktérium Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, és Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, és egy élesztő Candida albicans ATCC 10231 nyertünk Oxoid (Basingstoke, Egyesült Királyság). A kationhoz igazított Mueller-Hinton táptalajt (MHB) és Sabouraud dextróz táptalajt (SDB) használtunk antibakteriális és gombaellenes mikrodilúciós vizsgálatokhoz, és trisz-pufferolt sóoldattal (Sigma-Aldrich, Prága, Csehország) egyensúlyoztuk. A baktericid, illetve a fungicid koncentrációk későbbi meghatározásához Mueller-Hinton agart (MHA) és Sabouraud dextróz agart (SDA) alkalmaztak. Az összes adathordozót az Oxoid-tól vásárolták (Basingstoke, Egyesült Királyság).

2.4. Minimális gátló koncentráció (Mic) meghatározása

a Mic-ket in vitro táptalaj mikrodilúciós módszerrel határoztuk meg a Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) irányelveit követve, amelyeket a természetes termékek fertőzésellenes potenciáljának hatékony értékelésére javasolt ajánlásoknak megfelelően módosítottak 96 lyukú mikrotiter lemezek alkalmazásával. Röviden, Az EO-t feloldottuk DMSO-ban Tween 80 hozzáadásával, és kétszeres soros hígításokat készítettünk MHB-ben a baktériumok és SDB-ben az élesztő számára, míg a vizsgált koncentrációk 4-2048) voltak. Az inokulumot egy éjszakán át tartó tenyészetekből állítottuk elő úgy, hogy a mikrolemezekben a kezdeti CFU-koncentráció a baktériumok, illetve az élesztő esetében 5 105, illetve 2 103 CFU/mL volt. A beoltott lemezeket 24 óra inkubáció után 35 CC-n, majd C. albicans esetében még egyszer 48 óra után vizsgáltuk. A mikrobiális növekedést spektrofotometrikusan mértük Multiscan Ascent mikroplate Fotométerrel (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) 405 nm-en. A mic-ket a legalacsonyabb koncentrációban fejeztük ki, amely képes gátolni a baktériumok szaporodásának 80% – át a pozitív növekedési kontrollhoz képest. A kísérleteket három példányban, három független tesztben végeztük, és a Mic-k kiszámításához medián értékeket használtunk. Az Eo illékony komponenseinek a szomszédos kutak mikrobiális növekedésére gyakorolt hatásának nemrégiben jelentett lehetősége miatt pozitív növekedésszabályozó sorokat illesztettünk az EO hígítási sorok közé az esetleges növekedési hatás kimutatása érdekében. Az alkalmazott oldószerek a vizsgált koncentrációkban nem gátolták a baktériumok szaporodását. A ciprofloxacint és a tiokonazolt használták referencia antibiotikumként a baktériumok, illetve az élesztő esetében.

2, 5. Minimális baktericid koncentráció (MBC) és minimális fungicid koncentráció(MFC) meghatározása

a 20cl alikvotokat mikrobiális növekedés nélkül minden egyes kútból az MHA lemezekre (SDA lemezek a C. albicans esetében) 24 óra, illetve 48 óra inkubáció után a vizsgált baktériumok, illetve élesztő. A lemezeket ezután 24 órán át inkubáltuk 35 C. C. az MBC – T és az MFC-t a CFU 99,9% – os csökkenéseként értékelték az inokulumhoz képest, mindezt három példányban, három független tesztben.

3. Eredmények és megbeszélés

3.1. Az olajok és a bioaktív frakciók

összetevőinek kémiai jellemzése A Clevenger típusú berendezéssel végzett eo hidrodesztillálás 0,02% (m/v) sárgásbarna olajat eredményezett, amely szobahőmérsékleten megszilárdul, ami valószínűleg a zsírsavak magas aránya (összesen 32,23%) miatt következik be. Az EO GC-MS elemzése több mint 70 alkotóelem jelenlétét mutatta ki, a palmitinsav (18,47%) a leggyakoribb komponens, amelyet timol (7,97%), mirisztinsav (4,71%), linalool (4,65%), anetol (4,09%), linolénsav (3,81%), hexahidrofarnesil-aceton (3,16%), laurinsav (2.79%), α-terpineol (2.39%), and borneol (2.39%). The main compounds are shown also in the chromatogram (Figure 1) and the complete list of EO constituents is presented in Table 1.


Peak number	Component	RI	Area (%)	ID	Peak number	Component	RI	Area (%)	ID

1	1-Hexanold	—	0.10	a	41	Damascenone	1385	0.56	a, b
2	1-Octen-3-ol	981	1.82	a, b	42	Methyl eugenol	1406	0.23	a, b
3	β-Myrcene	992	0.14	a, b, c	43	Caryophyllene	1419	1.28	a, b, c
4	3-Octanol	996	0.13	a, b	44	Geranyl acetone	1455	0.89	a, b
5	p-Cymene	1027	0.81	a, b, c	45	Trans-β-farnesene	1460	0.13	a, b
6	Limonene	1032	0.34	a, b, c	46	Alloaromadendrene	1462	0.12	a, b
7	Eucalyptol	1034	0.25	a, b, c	47	γ-Muurolene	1478	0.25	a, b
8	γ-Terpinene	1062	0.34	a, b, c	48	Germacrene D	1482	0.31	a, b
9	Sabinene hydrate	1070	0.14	a, b	49	Curcumene	1484	1.21	a, b
10	1-Octanol	1074	0.40	a, b	50	Trans-β-ionone	1487	1.53	a, b
11	3,5-Octadienoned	1094	0.16	a, b	51	Valencene	1493	0.13	a, b
12	Linalool	1101	4.65	a, b, c	52	α-Selinened	1495	0.17	a, b
13	α-Thujone	1106	0.88	a, b	53	Epizonarened	1498	0.26	a, b
14	β-Thujone	1118	0.48	a, b	54	α-Muurolene	1500	0.18	a, b
15	Camphor	1146	1.00	a, b, c	55	β-Bisabolene	1510	0.94	a, b
16	Menthone	1156	1.98	a, b, c	56	γ-Cadinene	1515	0.40	a, b
17	2-Nonenal, (E)-	1163	0.10	a, b	57	Nerolidold	1566	0.10	a, b
18	Borneol	1168	2.39	a, b, c	58	Lauric acid	1574	2.79	a, b
19	(+/−)Lavandulol	1170	0.16	a, b	59	Spathulenol	1578	0.61	a, b
20	Menthol	1175	2.02	a, b, c	60	Caryophyllene oxide	1583	1.47	a, b
21	4-Terpineol	1179	1.13	a, b	61	Pseudoiononed	1587	0.18	a, b
22	α-Terpineol	1191	2.39	a, b	62	Humulene epoxide II	1609	0.25	a, b
23	Estragole	1199	0.34	a, b, c	63	Longifolenaldehyded	1613	0.20	a, b
24	Decanal	1207	0.15	a, b	64	τ-Cadinol	1643	0.18	a, b
25	β-Cyclocitrald	1222	0.21	a, b	65	β-Eudesmol	1651	0.13	a, b
26	Thymol methyl ether	1238	0.75	a, b	66	Myristic acid	1771	4.71	a, b
27	Cumin aldehyde	1242	0.23	a, b	67	Hexahydrofarnesyl acetone	1847	3.16	a, b
28	Neral	1244	0.14	a, b	68	Pentadecanoic acid	1865	0.28	a, b
29	Carvone	1246	1.28	a, b, c	69	Farnesyl acetone	1919	0.50	a, b
30	Piperitone	1256	0.18	a, b	70	Palmitic acid	1977	18.47	a, b
31	Geraniol	1258	0.79	a, b	71	Phytold	2114	0.12	a, b
32	Trans-2-decenald	1264	0.11	a, b	72	Linoleic acid	2143	1.90	a, b
33	Geranial	1273	0.15	a, b	73	Linolenic acid	2148	3.81	a, b
34	Anethole	1287	4.09	a, b	74	Tricosane	2300	1.79	a, b
35	Safrole	1289	0.21	a, b	75	Tetracosane	2400	0.16	a, b
36	Thymol	1295	7.97	a, b, c	76	Pentacosane	2500	1.36	a, b
37	Carvacrol	1304	1.96	a, b, c
38	(E,E)-2,4-Decadienal	1318	0.21	a, b		Total identified		98.91
39	Capric acid	1374	0.26	a, b
40	α-Copaene	1377	0.15	a, b

R: retention indices relative to n-alkanes on HP-5MS capillary column (30 m × 0.25 mm, 0.25 m); peak area relative to total peak area in %; ID: identification method; a: identification based on mass spectra matching; b: identification based on retention index; c: azonosítás a hiteles minta coinjection alapján; d: kísérleti azonosítás.

1.táblázat

az Euphrasia rostkoviana Hayne illóolaj kémiai összetétele.

1.ábra

az Euphrasia rostkoviana illóolaj tipikus kromatogramja. A fő összetevőket a retenciós idők sorrendje szerint jelöljük. (12) Linalool; (22) xhamster-terpineol; (34) anetol; (36) timol; (37) karvakrol; (58) laurinsav; (66) mirisztinsav; (67) hexahidrofarnesil-aceton; (70) palmitinsav; (73) linolénsav.

a magas zsírsavtartalmat korábban az E. stricta EO-ban (összesen 25,7%) találták, a legnagyobb arányban palmitinsavat (20,3%) és mirisztinsavat (3,9%) . Nincs azonban más olyan vegyület, amely jelentős mennyiségben jelen lenne, ami jelezné e két Euphrasia faj rokonságát.

3.2. Antimikrobiális aktivitás

Az E. a rostkoviana EO aktivitást mutatott a hétből hat organizmus ellen, amelyeket Mic-kkel teszteltek 512-től 2048-ig. A Gram-pozitív baktériumok érzékenyebbek voltak, mint a Gram-negatív baktériumok és az élesztő, míg a P. aeruginosa volt az egyetlen szervezet, amelyet az olaj nem gátolt a legmagasabb koncentrációkban. Az EO összes vizsgált mikroorganizmusra vonatkozó Mic-jeit, MBCs-jeit és MFC-jeit a 2.táblázat foglalja össze. Az aktív koncentrációk összehasonlíthatók azokkal, amelyeket korábban jelentettek például az Artemisia annua, az Eucalyptus globulus, a Mentha suaveolens, a Myrtus communis, az Ocimum basilicum vagy a Thymus vulgaris EOs esetében, különösen antikandidális aktivitás esetén . Az olaj hatékonyabb volt, mint a Teixeira és Silva által E. coli, E. faecalis, S. aureus és S. epidermidis ellen tesztelt E. rostkoviana kivonatok. A referencia antibiotikumok mikrofonjai az E-re érzékeny baktériumok és élesztő ellen. a rostkoviana EO összhangban volt a CLSI elfogadható határértékeivel, illetve a korábbi jelentésekkel .


Microorganism	Euphrasia rostkoviana EO					CIP	TIO
	MIC (µg/mL)		IC50 (µg/mL)		MBC/MFC (µg/mL)	MIC (µg/mL)	MIC (µg/mL)
	24 h	48 h	24 h	48 h	24 h	24 h	48 h

Enterococcus faecalis	512	—	128	—	1024	0.5	—
Staphylococcus aureus	512	—	128	—	>2048	0.5	—
Staphylococcus epidermidis	512	—	256	—	>2048	0.25	—
Klebsiella pneumoniae	2048	—	1024	—	>2048	0.125	—
Escherichia coli	2048	—	1024	—	>2048	0.015	—
Pseudomonas aeruginosa	>2048	—	>2048	—	>2048	0.125	—
Candida albicans	128	1024	128	1024	2048	—	0.063

The growth inhibition was measured after 24 h and 48 h of incubation in case of C. albicans; EO: essential oil; CIP: ciprofloxacin; TIO: tioconazole; MIC: minimum inhibitory concentration; IC50: inhibitory concentration causing ≥50% of bacterial growth; MBC: minimum bactericidal concentration; MFC: minimum fungicidal concentration.

Table 2

The inhibitory and cidal concentrations of E. rostkoviana essential oil.

mivel a fő eo alkotó palmitinsav tartalma nem haladja meg a 20% – ot, és több mint 10 egyéb antimikrobiális hatóanyag van 1-8% között, nehéz javasolni az E. rostkoviana eo antimikrobiális hatásáért felelős fő szereket. A palmitinsavat korábban a gram-negatív, de nem Gram-pozitív baktériumok ellen aktív frakciók fő vegyületeként azonosították . Másrészt a közepes láncú telített zsírsavakról és a hosszú láncú telítetlen zsírsavakról ismert, hogy gátolják különösen a Gram-pozitív baktériumokat . Ezenkívül a laurinsav számos gombával szemben is aktivitást fejt ki . Így az Eo antimikrobiális aktivitása valószínűleg az antimikrobiális zsírsavak komplex hatásának köszönhető az Eo-ban azonosított egyéb jól ismert antimikrobiális vegyületekkel, például anetollal, borneollal, kámforral, karvakrollal, linaloollal, mentollal, antioxidánsokkal-terpineollal vagy timollal.

4. Következtetések

összefoglalva, a kémiai elemzés számos antimikrobiális hatóanyagot tárt fel az E-ben. a rostkoviana EO és a Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok elleni gombaellenes és antibakteriális hatása megerősítést nyert. Legjobb tudomásunk szerint ez az első jelentés az E. rostkoviana eo összetételéről és antimikrobiális aktivitásáról.

összeférhetetlenség

a szerzők kijelentik, hogy e cikk közzétételét illetően nincs összeférhetetlenség.

elismerések

ezt a munkát az Európai Tudományos Alapítvány és a Cseh Köztársaság Oktatási, Ifjúsági és Sportminisztériuma, a CZ projekt támogatta anyagilag.1.07/2.3.00/30.0040; a Cseh Köztársaság Oktatási, Ifjúsági és Sportminisztériumának s-támogatásával; valamint a Cseh Élettudományi Egyetem Prágai projektje IGA 20155012. A szerzők hálásak Slavka Barlakovának az angol lektorálásért.