A HPV/p16 pozitív és negatív HNSCC különbségeket mutat a csomópont érintettségében
meghatároztuk a HPV és p16 státusát 241 oropharyngealis laphámsejtes karcinómában (OPC) kezelt betegek (kemo)sugárzás (c)RT. Az emberi tumormintákat a Leuven (Leuven, Belgium) Egyetemi Kórházak Etikai Bizottsága által jóváhagyott protokollok szerint szerezték be, és az összes beteg hallgatólagos beleegyezését megszerezték. Klinikai patológiai adatokat vontak ki a betegtérképekből, és az átlagos követési idő 4,19 év volt. A HPV-pozitív betegeket alacsonyabb T-stádiumok jellemezték, a HPV-negatív csoportban a HPV-pozitív betegek 45% – a (26 az 58-ból; p = 0,025) T1/2 stádiumú daganatot mutatott, míg ez 29% (51 a 175-ből; p = 0,025) volt. Sőt, a HPV pozitív daganatok szignifikánsan magasabbak voltak (p = 0.014) nodális részvétel a HPV pozitív betegek 72% – ával (42 az 58-ból) N2/N3 tumorokat mutat, míg ez csak 54% volt (95 a 175-ből) a HPV negatív csoportban. Bár a P16 státusz és az N stádium közötti kapcsolat nem volt szignifikáns, a magasabb nodális részvétel és a p16 pozitivitás tendenciája volt megfigyelhető. A P16 pozitív betegek hatvanhárom% – a mutatott N2/N3 tumorokat, míg ez csak 54% volt a P16 negatív csoportban (1.táblázat). Ezek az eredmények összhangban vannak más vizsgálatokkal, amelyek azt mutatják, hogy a HPV pozitív HNSCC betegek magasabb N és alacsonyabb T stádiumúak .
a várakozásoknak megfelelően az alacsony T stádiumok jobb távoli kontroll (DC) arányokat eredményeztek, az 5 éves kontroll arány 83% és 70% (p = 0,04) a T1/T2, illetve T3/4 daganatok (1. kiegészítő fájl: S1A ábra). N2 / 3 daganatok (5 éves DC 70%; p = 0,02) nagyobb kockázatot mutatott a távoli kudarcra, mint az N0/1 daganatok (5 éves DC arány 85%; p = 0,02) (további fájl 1: S1B ábra). Nem figyeltek meg statisztikailag szignifikáns különbséget a HPV-pozitív és a negatív betegség DC-arányában (5 éves DC-Arány 82% vs 5 éves DC-Arány 72%; p = 0,20) (1.kiegészítő fájl: S1C ábra). Bár nem jelentős, ez a 10% – os különbség a DC arányokban a vírus hatását sugallja a helyi tumor kontrollon túl. Ezenkívül azt jelzi, hogy a HPV pozitív és negatív HNSCC között különböző terjesztési minták vannak jelen.
a p16 elnyomja a HPV pozitív HNSCC inváziós és migrációs kapacitását
a metasztázisban észlelt potenciális különbségek mögött meghúzódó molekuláris mechanizmus vizsgálatához betegcsoportunkban a HNSCC sejtek in vitro migrációját és inváziós képességét értékeltük. A HPV/p16 pozitív SCC154 és SCC104 sejtek szignifikánsan alacsonyabb migrációs rátát mutattak a HPV / p16 negatív sqd9, CAL27 és SC263 sejtekhez képest (ábra. 1a). A migrációs vizsgálattal egyetértésben a HPV / p16 pozitív sejtek csökkent inváziós képességeket mutattak a HPV/p16 negatív sejtekhez képest (ábra. 1b).
p16 represses the in vitro invasion and migration capacity of HPV positive HNSCC. a Migration capacity of HPV negative cells (SQD9, CAL27 and SC263) and HPV positive cells (SCC154, SCC104). b Invasion capacity of HPV negative SQD9 cells and HPV positive SCC154 cells. c Migration capacity of HPV positive SCC154 cells treated with shRNA for p16 (shp16) and control (shluc). a P16 (shp16) és a kontroll (shluc) szempontjából shRNS-sel kezelt HPV pozitív SCC154 sejtek D inváziós kapacitása. (a-d) az eredményt három kísérlet átlaga szerint mutatjuk be, és a p-értékeket kétoldalas t-teszttel számítjuk ki
a P16 tumorszuppresszor egy jól ismert sejtciklus-szabályozó és a HPV pozitív HNSCC jó helyettesítő markere . Ezenkívül a legfrissebb adatok szélesebb körű szerepet tulajdonítanak a p16 – nak, beleértve a migrációban és az angiogenezis visszaszorításában betöltött szerepet . Ezért megvizsgáltuk a P16 hatását a HPV pozitív SCC154 sejtek migrációs és inváziós kapacitására, amelyeket rövid hajtű RNS-sel (shp16) manipuláltak a p16-ra (shluc) és a kontroll shRNS-re (shluc). A p16 expresszió csökkentése növelte az SCC154 sejtek migrációs és inváziós kapacitását (ábra. 1c és d). Ezek az adatok igazolják a HPV pozitív és negatív HNSCC közötti disszeminációs mintákban mutatkozó különbségeket, és arra utalnak, hogy a P16 aktív szerepet játszik a metasztatikus kaszkádban.
a P16 elnyomja a migrációt és az inváziót az angiogenezis révén a HPV pozitív HNSCC-ben
jól ismert, hogy az angiogenezis, amelyet a rákos sejtekben aktívan tartanak fenn olyan pro-angiogén tényezők, mint a vaszkuláris endothel növekedési faktor a (VEGFA), a rákos sejtek terjedésének és metasztázisának csatornája, és elősegíti az agresszív tumor progresszióját . Ezenkívül a HPV/p16 és a VEGFA közötti negatív korrelációt korábban a HNSCC írta le . Ezért megvizsgáltuk a HPV, a P16 és a VEGFA közötti kapcsolatot a beteg kohorszunkban. A HPV pozitív betegek szignifikánsan alacsonyabb VEGFA expressziót mutattak, a betegek 54% – ánál (28 Az 51-ből) nem vagy alacsony VEGFA expressziót mutattak, szemben a HPV negatív csoport 32% – ával (53 a 161-ből) (2.táblázat). Bár a VEGFA és a p16 közötti negatív korreláció kevésbé volt kifejezett, a szignifikancia tendenciája megfigyelhető volt (2.táblázat).
tovább vizsgáltuk az angiogenezis és a p16 közötti kapcsolatot in vivo XENOGRAFTOKKAL, amelyeket SCC154 HPV pozitív sejtekkel injektáltak shp16-tal manipulálva vagy shluc. Az alacsony p16 expresszióval rendelkező egerekben nagyobb számú eret észleltek a kontroll tumorokhoz képest (ábra. 2a). Ezenkívül a vaszkularizáció növekedése alacsonyabb nekrózist, nagyobb számú mitotikus sejtet és az shp16-ot expresszáló tumorok növekedési előnyét eredményezte (további Fájl 2: S2A-C ábra). Nem tudtuk ellenőrizni a P16 in vivo metasztázis szuppressziójában való részvételét a metasztatikus állatmodell hiánya miatt. Az shp16 egerek tumoraiban tapasztalt növekedési előny és fokozott vaszkularizáció azonban megmagyarázhatja az előrehaladott T stádiumok gyakori előfordulását HPV negatív HNSCC betegeknél.
a p16 kettős szerepe a HNSCC terjesztésében. véredényképződés SCC154 shp16 és SCC154 shluc xenograft egérmodellekben, CD31 festéssel értékelve (a grafikon felett); n = 5. b a Lyve-1 festéssel értékelt scc154 shp16 és SCC154 shluc xenograft egérmodellek nyirokérképződésének átlagos száma (a grafikon felett); n = 5. c az alpha4 béta1 integrin festés átlagos pontszáma SCC154 shp16 és SCC154 shluc egér xenograft modellekben; n = 5. d Average score of alpha4 beta1 integrin staining in HPV positive SCC154 (n = 7) and HPV negative SQD9 (n = 10) mouse xenograft models. az a-d P-értékeket kétoldalas t-teszttel számítjuk ki
a P16 stimulálja a lymphangiogenezist és a csomók terjedését HPV pozitív HNSCC-ben
ezek az eredmények még mindig nem magyarázzák a hasonló távoli relapszusok előfordulását a HPV / p16 pozitív és negatív HNSCC-ben szenvedő betegeknél, és természetesen nem magyarázzák a HPV / P16 pozitív és negatív hnscc-ben szenvedő betegek közötti rendkívül jelentős összefüggést a pozitivitás és a nodális részvétel leírása a mi és számos más tanulmányunkban . Ez különösen fontos, mivel magában foglalja a magas helyi metasztatikus potenciál jelenlétét a HPV pozitív HNSCC-ben. Érdekes módon a lymphangiogenezis, mint az angiogenezis, elősegíti a tumor metasztázisát azáltal, hogy új nyirokerek növekedését indukálja a tumorban, és fokozza a sejtek nyirokcsomókba történő kereskedelmét. Ezenkívül a daganatokban a megnövekedett nyirokér-sűrűség a nyirokcsomók fokozott metasztázisával jár. . Ezért a nyirokerek képződését homológ nyirokér hialuronán (LYVE-1) immunfestéssel vizsgáltuk shluc és shp16 egerek tumoraiban. Megállapítottuk, hogy a p16 szuppresszió alacsonyabb nyirokrendszeri sűrűséget eredményezett a HPV/p16 pozitív xenograftokban, ami a P16 kettős szerepére utal metasztázisban (ábra. 2b).
a p16 funkciójának megértéséhez az integrinekre összpontosítottunk, mivel ezek a fehérjék az angiogenezis és a lymphangiogenezis kulcsfontosságú szabályozói . Ezenkívül a P16 integrinekhez való kötődését és a sejtek terjedésének elvesztését korábban dokumentálták . Az integrinek, például az alpha4 béta1 a lymphangiogenezis fontos modulátorai . Ezért megvizsgáltuk az alfa4 béta1 integrin jelenlétét SCC154 shluc és SCC154 shp16 egerek tumoraiban. Although not statistically significant (p = 0.09), shluc tumors showed a higher percentage of integrin compared to shp16 tumors (Fig. 2c). In line with SCC154 shRNA xenografts, tumors from HPV/p16 positive SCC154 xenografts showed higher percentage of alpha4 beta 1 integrin compared to tumors from HPV/p16 negative SQD9 xenografts (Fig. 2d).