a bakteriofágok, más néven fágok, olyan vírusok, amelyek specifikusan megfertőzik a baktériumokat, és megerősíthetjük jelenlétüket és számszerűsíthetjük őket egy plakkvizsgálatnak nevezett eszközzel. A bakteriofágok megfertőzik fogékony gazdaszervezeteiket azáltal, hogy először a baktérium sejtfalához kötődnek, és genetikai anyagukat injektálják. Ezután eltérítik a sejt bioszintetikus gépezetét, hogy megismételjék DNS-ét, és számos utódfág részecskét hozzanak létre, amelyeket azután felszabadítanak a gazdasejt lizálásával és megölésével.

Ez a litikus aktivitás az alapja egy széles körben alkalmazott fágszámláló technikának, amelyet plakkvizsgálatnak vagy kettős agar rétegvizsgálatnak neveznek. Itt először bakteriofág keveréket készítünk egy alacsony koncentrációjú agarot tartalmazó olvadt tápanyaglevesben. A keverékben használt összes baktériumnak életben kell lennie és aktívan osztódnia kell növekedésük naplófázisában, ami biztosítja, hogy a baktériumok nagy része életképes legyen, és sűrű gyepet képezzen a plakkok körül. Ezután ezt az olvadt baktérium-fág agar keveréket egy szilárdabb, koncentrált agar tápközegre terítjük, amely már megszilárdult egy Petri-csészében. Szobahőmérsékleten történő inkubáláskor az alacsony koncentrációjú agar-fág-baktérium húsleves is megszilárdul, hogy lágy agarréteget képezzen.

itt a baktériumsejtek további tápanyagokat nyerhetnek az alsó rétegből, és gyorsan szaporodniuk kell, hogy a baktériumok összefolyó gyepét hozzák létre. Mivel azonban a fágrészecskék a lágy rétegben is jelen vannak, ezek megfertőzik és reprodukálják genetikai anyagukat a baktériumokon belül, amelynek csúcspontja a sejtlízis, amely több utódot szabadít fel. Ezek a fág utódok ezután megfertőzik a szomszédos sejteket, mivel a baktérium-fág réteg félszilárd állapota korlátozza mozgásukat a távolabbi elhelyezkedésű gazdasejtekre. Ez a ciklus a fertőzés és lízis folytatódik több fordulóban, megöli a nagyszámú baktérium egy lokalizált területen. A szomszédos sejtek elpusztításának hatása az, hogy egyetlen kör alakú tiszta zónát, úgynevezett plakkot hoznak létre, amely szabad szemmel látható, hatékonyan felerősítve a fág baktériumok litikus aktivitását és lehetővé téve azok felsorolását.

A Petri-csészében lévő plakkok számát Plakkképző egységeknek vagy PFU-knak nevezzük, és feltéve, hogy a kezdeti bakteriofág koncentráció kellően híg volt, közvetlenül meg kell felelnie az eredeti mintában található fertőző fágrészecskék számának. Ez a technika felhasználható a plakk morfológiájának jellemzésére, a fágtípusok azonosításának elősegítésére vagy a fágmutánsok izolálására is. Ebben a laboratóriumban megtanulja, hogyan kell elvégezni a plakkvizsgálatot a fágok felsorolásához, példaként az E. coli T7 fágját használva.

először azonosítsunk egy megfelelő táptalajt a gazdaszervezet baktériumsejtjeinek és a bakteriofágnak a tenyésztésére. Itt lizogén táptalajt vagy LB táptalajt használtak az E. coli és a T7 fág tenyésztésére. Ezután vegyen három tiszta üvegpalackot, Címkézze fel őket médiával, névvel, majd az elsőt LB-Húslevesként, a másodikat lb-alsó Agar, a harmadikat pedig lb-felső Agar néven. Most mérjünk ki négy gramm előre elkészített LB port három készletben, majd vigyünk át egy-egy lemért szárított táptalajt minden palackba. Adjunk hozzá 200 ml vizet az első palackhoz. Keverje össze a tartalmat mágneses keverőrúd segítségével.

ezután pH-mérővel és állandó keverés közben nátrium-hidroxid vagy sósav hozzáadásával 7,4-re állítsuk a végső pH-t. Ismételje meg a víz hozzáadását és a pH beállítását a másik két palacknál is. Most mérjünk ki három gramm agar Port, és adjuk hozzá a második üveghez, hogy 1,5% – os alsó agar legyen. Végül mérjünk 1-et. 2 gramm agar, majd adjuk hozzá a harmadik üveg, hogy a .6% font felső agar. A palackban lévő húsleves állapota nem igényel agar-kiegészítést. Zárja le a palackot félig szorosan, majd sterilizálja a közeget 121 Celsius fokos autoklávozással 20 percig. Miután elkészült, vegye ki a Média palackokat az autoklávból, és azonnal csavarja be a palack kupakját, hogy teljesen lezárja őket a szennyeződés elkerülése érdekében. Tartsa az LB-húslevest és az LB-Top Agar táptalajt a padon későbbi felhasználás céljából. Helyezze az LB-alsó agart lehűlni egy körülbelül 45 Celsius fokos vízfürdőbe.

amikor az LB-alsó agar eléri a körülbelül 45 Celsius fokot, helyezze át a munkapadra. Ezután sterilizálja a munkaterületet 70 % etenollal. Ezután adjunk hozzá 450 mikroliter steril egy moláris kalcium-kloridot az olvadt alsó agarhoz, hogy a végső koncentráció 2 legyen.25 millimoláris. Óvatosan forgassa az üveget a keveréshez. Ezután állítson be hét tiszta Petri-csészét. Címkézzen fel minden edényt az alján a Média nevével és az elkészítés dátumával. Ezután öntsön 15 ml alsó agart a hét Petri-csészébe. Hagyja a lemezeket néhány órán át vagy egy éjszakán át szobahőmérsékleten állni. A beállítás után a tenyészlemezek szükség esetén négy Celsius fokon tárolhatók több napig, fejjel lefelé a kondenzáció minimalizálása érdekében. Vigye át a Petri-csészéket a négy Celsius fokos hűtőszekrényből egy 37 Celsius fokos inkubátorba egy órával a vizsgálat előtt.

a vizsgálat előtti napon az E. coli-t tenyészteni kell. Itt 10 mikroliter E. coli kultúrát oltottunk be 10 ml LB-húslevesbe. Helyezze a baktériumokat egy éjszakán át egy 37 Celsius fokos, 160 fordulat / perc sebességgel beállított remegő inkubátorba. Ezután a vizsgálat napján távolítsa el a baktériumtenyészetet az inkubátorból. Vetőmag friss 10 ml friss LB húslevest 0,5 ml éjszakai tenyésztéssel. Helyezze ezeket a sejteket, hogy egy 37 Celsius fokos, 160 fordulat / perc sebességgel beállított remegő inkubátorba növekedjenek. Ezután spektrofotométerrel ellenőrizze, hogy ez a tenyészet eléri-e a log fázis növekedését, amelyet 0,5-0,7 optikai sűrűség jelez. Amint az OD eléri ezt a szintet, állítsa le az inkubációt a sejttenyészetnek a padra történő átvitelével. Most már készen állnak a fág overlay vizsgálatra.

a fág titerek exponenciálisan változhatnak a különböző fágtípusok és minták között. Tehát ahhoz, hogy hatékonyan megszámolhassuk őket, hígítani kell őket, hogy a fágkoncentrációk széles skáláját hozzák létre. A vizsgálat napján 10-szeres hígítási technikát követve egy tizedtől egymilliomod koncentrációig terjedő fághígítások sorozatát kell előállítani. A statisztikailag szignifikáns és pontos adatok megszerzéséhez a sorozathígítást három példányban kell elvégezni.

ezután mikrohullámú sütő segítségével megolvasztja a megszilárdult LB-top agart. Ezután helyezze egy vízfürdőbe, amely egy órán át 45 Celsius fokon van előre beállítva. Egy óra múlva gyűjtsük össze az inkubátorból az alsó agar réteget tartalmazó Petri-edényeket. Címkézze fel a lemezeket a fágkoncentrációval és a vizsgálat dátumával. Ezután állítson be hét tiszta kémcsövet. Címkézzen fel minden kémcsövet a Soros fághígítási számmal, és jelöljön ki egyet kontrollként.

amikor az LB-top agar eléri a 45 Celsius fokot, helyezze át a munkapadra. Most adjunk hozzá 450 mikroliter egy moláris kalcium-kloridot a 200 milliliter agar-hoz, hogy a végső koncentráció 2,25 millimoláris legyen. Óvatosan forgassa az üveget a keveréshez. Ezután adjunk hozzá 35 milliliter LB-top agart és négy milliliter bakteriális szuszpenziót egy steril kúpos csőbe. Óvatosan forgassa el a sejtek egyenletes eloszlása érdekében, de kerülje a rázást a habzás elkerülése érdekében.

most, aliquot öt milliliter ez a baktérium – top agar mix mind a hét kémcsövek. Ezután vigyünk át 100 mikrolitert a sorozatosan hígított bakteriofágmintákból és a kontrollközegekből, amelyeknek egyszerűen bakteriofág nélküli közegeknek kell lenniük, a tiszteletteljesen felcímkézett kémcsövekbe. A megfelelő keverés érdekében óvatosan forgassa meg a keveréket. Óvatosan vigyen át öt milliliter bakteriofág keveréket a megfelelő Petri-lemezre. A Petri-lemez finoman forgatásával egyenletesen ossza el a keveréket az egész felületen.

Miután az összes Petri-lemezt rétegeztük a keverékkel, hagyjuk a felső réteg megszilárdulását szobahőmérsékleten 15 percig inkubálva. Ezeknek a lépéseknek a befejezése után ismételje meg az eljárást a Petri-csészék második, majd harmadik készletére a fennmaradó két fághígító készlet felhasználásával. Zárjon le minden edényt parafilmmel, majd szobahőmérsékleten inkubálja 15 percig. Helyezze a tenyészlemezt fejjel lefelé megfelelő hőmérsékleten 24 órán át, vagy amíg a plakkok kialakulnak. Itt a lemezeket egy napra 37 Celsius fokos inkubátorba helyeztük, ami stimuláló növekedési feltétel E számára. coli és a T7 fág.

a plakkok egy-öt napos inkubáció után jelennek meg, a baktériumfajtól, az inkubációs körülményektől és a közeg megválasztásától függően. Itt a plakkok egy napos inkubáció után 37 Celsius fokon voltak láthatóak. Kezdje azzal, hogy ellenőrzi a kontrollal jelölt lemezeket, és győződjön meg arról, hogy ezekben a lemezekben nem keletkeztek plakkok, mivel ez vírusfertőzést jelezne. Az eredeti mintában a fág titer meghatározásához először a leginkább hígított fágmintát tartalmazó lemezekkel kell kezdeni, és a fedelek eltávolítása nélkül számolni kell a plakkokat, megjelölve azokat, hogy jelezzék, melyiket már megszámolták. Ismételje meg az egyes lemezek számlálását minden készletben. Egyes lemezeken túl sok vagy túl kevés plakk lehet számolni. Fontolja meg a 10-150-et, mint ideális plakkszámot.

ezután hozzon létre egy táblázatot, amely felsorolja a különböző hígítások és ismétlések plakkszám-értékeit. Ezután számítsa ki a plakkszám átlagos értékeit azon hígítólemezek esetében, amelyek az ideális plakkszámot tartalmazták. Ebben a példában ez volt a 10-től a mínusz háromig, a 10-től a mínusz négy hígítólemezig képződött plakkok átlagos száma. Most állítsa be a fághígítási tényezőt úgy, hogy a kapott átlagos plakkértékeket elosztja a megfelelő fághígítási tényezőkkel. Itt a 10-től a mínusz háromig, a 10-től a mínusz négy hígítólemezig képződött plakkok átlagos számát elosztottuk a megfelelő hígítási tényezőkkel, hogy megkapjuk a plakkképző egységek vagy PFU-k számát 100 mikroliter fágkeverékben. Az érték milliliterenkénti PFU-ra történő átalakításához szorozzuk meg a generált értékeket 10-gyel, mivel a bakteriofág átfedés előkészítési lépése során csak 100 mikroliter fághígító keveréket használtunk, további 10 hígítási tényezőt eredményezve. Végül számítsuk ki a különböző hígítólemezekből kapott értékek átlagát. Ez megadja a PFU-k átlagos számát milliliterenként. A PFU-k száma megegyezik az eredeti mintában lévő fertőző fágrészecskék számával.